二亚硝基哌嗪（DNP）活化Ezrin促进鼻咽癌细胞转移的分子机制研究

本项目在已有DNP介导大鼠鼻咽癌转移和诱导Ezrin蛋白活化的基础上，①采用分子动态模拟技术预测DNP与Ezrin蛋白N端FERM结合，推断DNP可能通过与其结合而活化Ezrin蛋白；②根据预测结果，构建不同结构Ezrin蛋白表达载体（含G135-E150、Q155-R180、K210-T214或T235-F267），核素标记DNP，放射自显影，分析DNP与Ezrin蛋白结合结构域以及其对Ezrin蛋白活化的影响，明确DNP与Ezrin蛋白结合诱导Ezrin活化；③将不同结构Ezrin表达载体导入Ezrin-/-细胞，DNP处理后，检测细胞侵袭移动能力；④分析DNP对PKC和Rho-kinase活性的影响，探讨DNP通过增强PKC和Rho-kinase活性促进Ezrin蛋白磷酸化，促进细胞侵袭转移。本项目的完成将阐明DNP参与鼻咽癌转移的分子机制，为鼻咽癌转移机制研究提供科学的理论依据。

鼻咽癌是我国南方常见的头颈部恶性肿瘤，严重危害我国人们身体健康。鼻咽癌高转移、高复发给临床治疗带来了极大困难，但发病机制尚不明了。①本项目采用Western-blotting、免疫组化技术等发现Ezrin和phos-Ezrin蛋白在鼻咽癌转移细胞和转移组织中高表达，表明Ezrin和phos-Ezrin蛋白与鼻咽癌转移密切相关。②研究发现鼻咽癌特异致癌物二亚硝基哌嗪（DNP）诱导鼻咽癌转移且诱导phos-Ezrin蛋白高表达，阻断phos-Ezrin Thr567表达，DNP诱导鼻咽癌转移潜力显著减低，提示DNP通过介导phos-Ezrin Thr567表达诱导鼻咽癌转移。③分子动态模拟技术发现DNP与Ezrin G135-E150（M1）、Q155-R180（M2）、K210-T214（M3）和T235-F267（M4）结合，通过构建载体pHis-EzrinM1、pHis-EzrinM2、pHis-EzrinM3和pHis-EzrinM4，利用同位素（3H-DNP）示踪技术确证DNP与G135-E150（FERM区）结合，提示DNP可能通过与Ezrin蛋白FERM区域结合活化Ezrin蛋白。④激酶分析实验发现，DNP通过与Rho激酶 Pleckstrin homology区域结合从而活化Rho激酶，通过促进PKC细胞亚定位激活PKC，通过Rho-kinase、PKC激酶介导Ezrin磷酸化。结果表明，DNP通过活化Rho-kinase、PKC，介导Ezrin蛋白磷酸化，从而促进鼻咽癌细胞转移。这为阐明鼻咽癌转移分子机理提供了一新的思路，为鼻咽癌的靶分子治疗和早期干预鼻咽癌转移提供科学的理论依据。