一种基于PEG/Tat共修饰笼形复合蛋白的肿瘤靶向纳米载体的构建及其抗肿瘤功效研究

小分子热休克蛋白具有笼形结构，内腔可作为药物贮库且内外表面均可修饰，是很有潜力的药物载体。本研究以热休克蛋白Mj-Hsp为母版，内腔结合载脂蛋白E的羧基端结构域以增强对疏水药物的包载能力；外部同时修饰穿膜肽Tat与PEG，其中PEG一端以酰腙键连接到Hsp，另一端连接抗EGF-R单抗，得到抗EGF-R单抗介导的PEG和Tat共修饰的Hsp纳米载体（APT-Hsp）。APT-Hsp以单抗介导对肿瘤的第一重靶向，而后在肿瘤pH下PEG脱落暴露出Tat肽，引导载药蛋白进胞实现二重靶向。本研究制备并表征APT-Hsp；以阿霉素为模型药考察其载药能力及释药行为；用A549肺癌细胞与HELF人胚肺成纤维细胞考察体外APT-Hsp被细胞摄取的机理及对肿瘤细胞的靶向性；考察其在Lewis肺癌小鼠体内的靶向性和抑瘤效果；同时还考察APT-Hsp的安全性。目的是开发出特异性靶向肿瘤的新型生物纳米载体。

本研究以天然笼形蛋白小分子热休克蛋白（sHSP）为核心，通过PEG桥连将穿膜肽TAT键合在HSP表面，得到TAT修饰的HSP（T-HSP）。设计合成pH敏感的磺胺嘧啶基/聚乙二醇基丙烯酸共聚物（PSPA），经静电作用与T-HSP结合得到PSPA 包衣的T-HSP（PT-HSP）。PT-HSP在生理pH下包衣化，在肿瘤pH去包衣化。通过这种pH敏感的包衣-去包衣转变，使TAT肽在正常组织被掩盖而在肿瘤组织被暴露，实现“智能”的肿瘤靶向性。T-HSP的平均粒径约为70nm，荷正电；PT-HSP的平均粒径约为140nm，荷弱负电。透射电镜可清晰地观察到PT-HSP的双层结构。PT-HSP在不同pH下的粒径变化证明其在pH 6.5附近发生包衣-去包衣的转变。PT-HSP在P及含4.5%BSA的PBS中均有较好的稳定性，表明PSPA包衣层可使PT-HSP免受血浆蛋白吸附。采用三氟乙醇解离重组与薄膜分散法结合的载药技术，将紫杉醇（PTX）包载进PT-HSP中，包封率为87%，载药量7.8%。载PTX的PT-HSP在pH7.4时的释放速率显著慢于pH6.5时，提示其在血液循环时药物释放缓慢而在到达肿瘤部位后迅速释放药物。PT-HSP能够被A549和HeLa两种肿瘤细胞大量摄取，而被正常细胞仓鼠肺细胞（CHL）摄取得极少，体现出良好的体外肿瘤靶向性。HSP亚基与PSPA的摩尔比与构成PSPA的PEG是影响PT-HSP进胞的两个关键因素。当HSP亚基与PSPA的摩尔比超过1:3并且PEG分子量较大（Mw=6K）时，PSPA包衣可完全掩盖TAT肽，抑制PT-HSP进入正常细胞。PT-HSP通过一种依赖能量的巨胞饮方式进入A549细胞而非受体介导的内吞，说明TAT肽对PT-HSP进胞起主导作用。T-HSP增加了PTX对细胞的杀伤，但不具选择性；PT-HSP能够使PTX选择性杀伤肿瘤细胞而减少伤害正常细胞。以荷H22肝癌小鼠考察PT-HSP纳米载体的体内抗肿瘤功效。从肿瘤生长曲线和抑瘤率比较，PT-HSP的抑瘤效力和安全性均优于PTX注射液。活体成像表明，PT-HSP能够靶向性地聚集在肿瘤，并在注射后20h仍能在肿瘤部位保持高浓度。安全性评价证明，PT-HSP不产生溶血，小鼠静脉注射PT-HSP空白载体无明显毒性。综上，PT-HSP是一种前景广阔的抗肿瘤药物递药载体。