TLR4、7对瘢痕疙瘩形成中Smad信号通路的调控作用及其机制研究

瘢痕疙瘩与TGF-β受体启动的Smad信号通路密切相关。最近研究显示Toll受体4（TLR4）可介导肝和肾纤维化，而激活TLR7有抗瘢痕作用。我们则发现突变型Smad4具有抗瘢痕作用，且瘢痕疙瘩中TLR4呈高表达而TRL7低表达，但其相互关系及作用机制不明。我们推测TLR4、7可能通过调控Smads表达而影响瘢痕疙瘩形成。本项目以原代分离的成纤维细胞（KFB）为体外模型，采用TLR4、7和Smad4/sTβRII特异靶基因表达调控技术，在细胞和分子水平上确定TLR4、7调控Smad4的表达、对KFB增殖与活化的影响、TLR4、7拮抗剂/激动剂以及突变型Smad4和sTβRII在细胞内外双位点抗瘢痕的作用机制，并以动物实验评价TLR4、7的表达调控在抗瘢痕疙瘩形成中的可行性及有效性。研究结果有助于深入了解瘢痕疙瘩形成的病理机制，为研发TLR4脂质聚糖类拮抗剂和sTβR作为抗瘢痕新药奠定基础。

背景：病理性瘢痕的形成与TGF-β诱导的Smad通路激活有着密切的联系；近年来有研究表明Toll样受体（TLR）4的激活会介导肾及肝脏组织的纤维化，而TLR7激活则能抑制病理性瘢痕生成，其作用机制仍不明确。本项目主要研究TLR4/7在瘢痕生成过程中与TGF-β/Smad通路的相互作用机制，及其用于抗瘢痕治疗的潜在价值。.主要研究内容：第一部分研究分析不同病理类型组织（瘢痕疙瘩组织、非病理性瘢痕组织）中TLR4/7、Smad4/7、结缔组织生长因子(CTGF)及细胞外基质(ECM)等分子的蛋白和基因表达水平。第二部分研究可溶性受体sTβRII和突变型Smad4基因转染体外培养的皮肤成纤维细胞，检测靶细胞Smad2/3、磷酸化的Smad2/3、TLR4、TLR7以及ECM的表达。第三部分通过激动TLR4、TLR7，检测靶细胞TGF-β受体II（TβRII）的表达变化；同时用人皮肤成纤维细胞构建体外阻断TLR4模型及激活TLR7模型，检测两种细胞模型在TGF-β1刺激下表达瘢痕相关蛋白的变化。第四部分构建兔耳外伤模型，在伤口上分别给予TLR4通路抑制剂ST2825、TLR7激动剂Gardiquimod，检测伤口愈合后瘢痕尺寸及胶原蛋白表达情况。.结果：（1）TLR4在瘢痕疙瘩组织中的表达明显高于非病理性瘢痕组织，并通过Smad4增加引起TGF-β及CTGF和胶原蛋白表达；而TLR7、Smad7则低表达或未见相应的增高；（2）皮肤成纤维细胞中，阻断TGF-β/Smad通路TβRII和Smad4两个位点均可抑制TGF-β通路激活及TLR4表达，促进TLR7表达，这种作用在TβRII和Smad4两个位点同时阻断时得到加强；（3）TLR4激动剂以剂量依赖方式提高TβRII及瘢痕相关蛋白的表达，这种作用可被ST2825及Gardiquimod所抑制；（4）动物伤口经TLR4通路抑制剂及TLR7激动剂处理后，瘢痕面积以及胶原沉积均明显低于对照组。.结论：TLR4、TLR7及TGF-β/Smad通路均参与创伤愈合过程，TLR4、TGF-β/Smad通路对创伤愈合及瘢痕生成有促进作用，这两条通路之间有正反馈调控机制，一旦失去平衡则会导致伤口过度愈合并产生病理性瘢痕，抑制着两条通路的转导过程会产生明显的抗瘢痕作用；TLR7通路在伤口愈合过程中受到抑制，激活TLR7通路亦可产生抗瘢痕作用。