纳米铁对土壤生物毒性效应快速分子诊断技术研究

本课题以建立纳米材料对土壤生态毒性效应快速评测方法为目的；选取环境修复常用材料纳米铁为研究对象，以赤子爱胜蚓为供试生物，利用分子生物学技术，研究不同特性纳米铁材料对蚯蚓的毒性效应，包括应激行为和急性毒性效应、信号传导机制及氧化损伤作用、跨膜机制及基因损伤等，且探明DNA损伤与纳米材料特性之间的相关性；并通过实时定量PCR、基因芯片技术对DNA分子诊断标靶基因进行研究，筛选出对纳米铁毒性效有特异性响应的基因，并构建与之相对应的赤子爱胜蚓基因表达关系模型；在此基础上，针对已筛选出的有明确表达差异的目标基因，设计纳米生物探针建立纳米铁毒性效应快速评测方法，为纳米产品的生物安全性评价、制订纳米企业工作环境的各项标准的提供依据。

课题组进行了不同特性（粒径、表面组成、投加剂量）纳米铁(nZVI)对赤子爱胜蚓的慢性毒性效应和回避实验研究。发现nZVI对蚯蚓的慢性毒性作用和回避行为与其的染毒时间、浓度以及纳米铁的类型均呈正相关。且nZVI浓度的升高导致蚯蚓体内蛋白质含量增加。同时蚯蚓体内三种抗氧化酶对nZVI浓度响应不同，在低浓度时CAT、SOD和GSH-PX均无响应，在高浓度时都呈现先增加后降低的趋势，但无显著的剂量-效应关系。通过体腔细胞DNA损伤实验发现经过28d，nZVI对赤子爱胜蚓体腔细胞未产生明显的DNA损伤。但随着纳米铁浓度的升高和接触时间的增加，中性红保持时间逐渐缩短，纳米铁对蚯蚓体腔细胞溶酶体膜有明显的损伤作用，并呈现“剂量-效应”关系。nZVI对赤子爱胜蚓的急性毒性效应研究表明，纳米铁属于低毒。以实时定量PCR、单细胞凝胶电泳（SCGE）、酶活及蛋白等方法评估了nZVI对蚯蚓抗氧化酶活性（SOD、CAT）及酶蛋白的基因表达（SODmRNA、CATmRNA）、抗氧化物含量（GSH、MT）及防御蛋白基因表达（MTmRNA）、脂质过氧化物产物MDA含量，以及DNA损伤等生理指标的影响, nZVI干扰了蚯蚓的细胞氧化还原体系，SOD和CAT的基因表达均有不同程度上调，酶活最高上升2.59倍，脂质过氧化产物MDA含量升高可达2.4倍。重金属类的生物标志物可指示nZVI暴露，其中GSH合成量最多上升了1.85倍，效应更明显持久的是MT（6.4倍）和MTmRNA（7.9倍），存在一定的剂量效应关系。单细胞凝胶电泳（SCGE）评估证明nZVI对大肠杆菌及蚯蚓体腔细胞没有DNA损伤。以细菌16SrDNA变性梯度凝胶电泳法（DGGE）分析了nZVI染毒后土壤及其中生物群落的变化，其他指标包括土壤物理结构、化学性质、微生物多样性指数，以及蚯蚓在其中的影响，证明nZVI对土壤性质的影响，1g/kg和10g/kg剂量纳米铁的加入能够提高土壤微生物群落多样性，两个剂量没有显著差异。