水稻花粉发育中钙依赖性蛋白激酶21调控的分子机制

水稻花粉发育钙信号受体-钙依赖性蛋白激酶（OsCDPKs），成为揭示其发育调控分子网络的核心枢纽蛋白。水稻花粉发育中OsCDPKs及其介导的级联途径作用分子机理的探索，对于认识花粉形成和/或败育新机制以及利用基因工程智能化创制新品种，拥有重大理论与实际意义。本项研究立足以往长期关于OsCDPKs调控水稻生殖器官发育细胞分子机理研究的理论基础，在利用转基因等技术证实了OsCDPK21缺失对花粉后期发育致死的基础上，观察败育的亚细胞结构变化；应用Pull-down Assay结合酵母双/三杂交与体外蛋白表达等技术，筛选克隆OsCDPK21的靶蛋白及其编码基因，鉴定其互作性质与方式及其生理作用,并利用转基因等技术，探明OsCDPK21及其靶蛋白介导的级联途径对水稻花粉发育调控的分子机制。本研究可奠定水稻花粉发育分子机制新理论基础,并以此为探索性开辟水稻智能化育种提供新依据与基因资源。

水稻花粉发育钙信号受体-钙依赖性蛋白激酶（OsCDPKs），成为揭示其发育调控分子网络的核心枢纽蛋白。水稻花粉发育中OsCDPKs及其介导的级联途径作用分子机理的探索，对于认识花粉形成和/或败育新机制以及利用基因工程智能化创制新品种，拥有重大理论与实际意义。本项研究立足以往长期关于OsCDPKs调控水稻生殖器官发育细胞分子机理研究的理论基础，在利用转基因等技术证实了OsCDPK21缺失对花粉后期发育致死的基础上，观察败育的亚细胞结构变化；应用Pull-down Assay结合酵母双/三杂交与体外蛋白表达等技术，筛选克隆OsCDPK21的靶蛋白及其编码基因，鉴定其互作性质与方式及其生理作用,并利用转基因等技术，探明OsCDPK21及其靶蛋白介导的级联途径对水稻花粉发育调控的分子机制。. 本项研究主要获得了重要的研究结果。OsCDPK21缺失转化致使花粉败育的超微结构研究表明，转基因水稻植株花粉发育成熟期发生了细胞凋亡，导致花粉败育。从而证明OsCDPK21可能参与了水稻花粉发育所必须的信号通路。通过OsCPK21特异互作蛋白及编码基因筛选与克隆研究，获得了水稻花粉成熟发育时期35个与OsCPK21特异互作候选蛋白。针对重要的候选互作蛋白Os14-3-3，开展了特异互作蛋白性质与互作方式及其功能的研究。通过酵母双杂交、体外GST-Pull down和双分子荧光互补实验（BiFC）等方式，验证了OsCDPK21与Os14-3-3之间相互作用的真实性。此外，通过体外磷酸化实验证明Os14-3-3可被OsCPK21磷酸化。采用氨基酸定点突变磷酸化活性检测结合phos-tag技术，探明Os14-3-3第138位的酪氨酸为OsCDPK21对其的磷酸化作用位点。此外，通过双分子荧光互补实验（BiFC）并结合激光共聚焦显微镜检测，证明了Os14-3-3第138位酪氨酸的突变并不影响其与OsCPK21之间的相互作用。实施了Os14-3-3及其突变子的过表达目标性转化，进而揭示了OsCDPK21介导的级联途径对花粉发育调控机制。. 本项研究结果可为揭示水稻花粉发育分子机制奠定新理论基础，并以此为探索性开辟水稻智能化育种提供新依据与基因资源。