端粒酶逆转录酶基因调控灵芝酸生物合成的机制研究

Ganoderma lucidum is a famous medicinal fungi. As the major pharmacologically active compounds, ganoderic acid (GA) has been considered a measurement of the quality of G. lucidum. To date, the GA biosynthetic pathway is basically clear, however, the mechanism of its regulation is not clear. In animals and plants, telomerase reverse transcriptase gene (TERT) has been suggested to have new biological function except for sustaining stable telomere lengths. However, there are few studies on TERT in filamentous fungi. In the preliminary works, the silenced strains of the telmerase reverse transcriptase in G. lucidum (GlTERT) were constructed. Interestingly, silencing GlTERT caused the decreased GA content. Thus, RNA interference and gene overexpression will be used to analyze the function of GlTERT in GA biosynthesis. Meanwhile, the reported signaling pathways affecting the GA biosynthesis will be used to clarify the mechanism of GlTERT regulating GA biosynthesis. These researches will be helpful for further elucidating the mechanism of GA biosynthesis regulating network, and provide theoretical basis for improving medical value of G. lucidum. Meanwhile, it will provide references for studying the new biological functions of TERT in other filamentous fungi.

灵芝酸是灵芝的主要活性药用成分，其含量的多少是衡量灵芝品质高低的重要指标。目前灵芝酸生物合成途径已经基本清晰，然而，其调控机制尚不清楚。在动植物中，端粒酶逆转录酶（TERT）已经被证明具有维持端粒长度之外的新生物学功能，而丝状真菌中关于TERT的研究相对缺乏。本项目前期构建了灵芝端粒酶逆转录酶基因（GlTERT）的沉默菌株，表型分析发现沉默GlTERT引起灵芝酸生物合成的下降。在此基础上，本项目拟通过RNA干扰和基因过表达的方法，分析GlTERT在调控灵芝酸生物合成中的作用。同时，结合已经报道的影响灵芝酸生物合成的信号途径，解析GlTERT调控灵芝酸生物合成的机制。研究结果将进一步解析灵芝酸生物合成的调控网络，为采用基因工程方法提高灵芝酸含量提供理论基础，同时，也为研究其它丝状真菌中TERT的新生物学功能提供借鉴。

灵芝酸具有免疫调节和抗肿瘤等多种药用功效。端粒酶逆转录酶是端粒酶的组成成分之一，除在维持端粒长度和染色体稳定性中发挥关键作用，还具有众多新生物学功能。本研究采用RNAi基因沉默和过表达技术分别探究了灵芝端粒酶逆转录酶基因（GlTert）的在灵芝中的新生物学功能，重点解析了GlTert调控灵芝酸生物合成的机制。本研究通过同源比对获得GlTert基因全长，其含三个保守结构域（TRBD、RT-G2-intron和TERT），在原基期和子实体时期表达量是菌丝期的3.37和4.77倍，参与调控热胁迫、氧化胁迫、细胞壁胁迫和渗透胁迫等逆境过程。构建GlTert基因沉默菌株（Terti8和Terti25）和过表达菌株（OE-6和OE-15）。相较灵芝野生型菌株，Terti8和Terti25菌丝直径分别降低30%和31%；生物量降低27%和32%；菌丝分叉间距降低64%和51%；H2O2处理下相对生长速率增加54%和61%；纤维素酶活性降低40%和42%；木聚糖酶活性均降低35%；胞内多糖降低34%和25%；灵芝酸含量降低46%和49%。ROS信号和Ca2+信号是参与调控灵芝酸合成的重要信号。沉默GlTert引起胞内ROS含量升高，抗氧化酶活性与相关基因表达下降；而引起胞内Ca2+含量及相关基因的表达降低。添加CaCl2可回复GlTert沉默菌株中降低的灵芝酸含量；同时添加CaCl2和Ca2+抑制剂，GlTert沉默菌株中降低的灵芝酸与对照组无差异。GlTert过表达菌株的研究获得相同结论。这些结果表明，GlTert通过胞内Ca2+信号调控灵芝酸的生物合成。同时，沉默灵芝端粒酶解旋酶GlTlh基因引起灵芝酸生物合成的降低，暗示在调控灵芝酸生物合成过程中，GlTert与GlTlh可能存在一定的互作。本项目研究结果进一步解析了灵芝酸生物合成的调控机制，为采用基因工程手段创制灵芝酸高产菌株提供理论基础。