适配子修饰的PLGA纳米基底特异性捕获循环肿瘤细胞和单细胞分析的研究

CTCs can be regarded as the 'liquid' biopsy of the tumor, thus providing convenient and noninvasive access to primary and metastatic tumor cells. Over the past decade, a diversity of technologies capable of detecting CTCs have been developed based on different operation mechanisms.However, detection and characterization of CTCs has been technically challenging due to the extremely low abundance of CTCs in the peripheral blood. Previously,we performed specific capture of CTCs in patients blood samples using aptamer which screened by cell-SELEX process modified nanosubstrates and carried out specific release of immobilized CTCs by treatment nuclease.We recovered high purity and viability CTCs from the two rounds of capture/release processes. In this project, we will further explore specific capture of CTCs in lung cancer patients blood using aptamer modified PLGA-nanosubstrates,and cut out single CTC using laser microdissection(LMD).We perform single CTC gene point mutation detection and exome sequencing,and analyses of CTCs could provide timely and reliable evidences on non-invasive cancer diagnosis, prognosis,response to therapy, prediction drug sensitivity and guidance individualized therapy; and it also helps us better understand the biological mechanisms of tumor metastasis.

循环肿瘤细胞（CTC）可以被看作肿瘤的"液态"标本，为原发瘤和转移瘤提供了便捷和无创的检测途径。近十年来已开发了原理各异的CTC检测技术，但CTC数量极少, 检测和分析CTC仍受到技术上的挑战。我们前期进行了用Cell-SELEX筛选的适配子修饰硅纳米芯片特异性捕获CTC和用核酸酶特异性释放CTC的研究，经过两轮捕获-释放后可获得高纯度和高活性的CTCs。本研究将进一步探讨用适配子修饰PLGA纳米芯片来特异性捕获肺癌病人外周血CTCs，然后运用激光显微切割技术把捕获的CTCs单个切割下来。对单个CTC进行基因点突变检测和外显子组测序，结果将为无创的肿瘤诊断、疗效评价、预后判断以及个体化治疗提供及时可靠的依据；也有助于我们更好地了解肿瘤转移的生物学机制。

对循环肿瘤细胞（CTCs）进行检测和分析，将为无创的肿瘤诊断、药敏检测、疗效评价、预后判断以及个体化治疗提供及时可靠的依据。但CTC数量极少, 检测和分析CTC仍受到技术上的挑战。本研究从多方面进行了CTCs的捕获、释放以及释放后CTCs的后续研究。首先，我们开发了一种新型的CTC捕获和释放平台，通过降低加热/降温过程次数和酶切法次数可获得高活性和高纯度的CTCs。回收的CTCs行体外细胞培养。我们使用ATP-TCA法 对回收的CTCs进行药敏试验，该方法可以确定回收CTCs最敏感的药物及其浓度，我们的方法能实现选择针对癌症患者个体化的最佳化疗方案；其次，我们设计了多肽-硅纳米线底物（Pe-SiNWS）。Pe-SiNWS具有高CTCs捕获效率（95.6%）和高释放效率（92.6%），可获得28.5%的纯度和93.5%的细胞活性。在16例胰腺癌患者中检测到5种类型的KRAS突变，而健康人中未检测到KRAS突变。我们的设备可同时实现CTC高效率捕获、轻微损伤的释放和精确的生物学分析;最后，我们用CTC捕获技术应用于临床。为了评估将恶性胸腔积液（MPE）作为基因检测替代样本的可行性，并确定MPE中肿瘤细胞基因检测结果在监测非小细胞肺癌（NSCLC）进展和疗效的意义。选择168例有MPE的NSCLC患者。我们用一个设计好的设备提取了MPE中的肿瘤细胞。用qRT-PCR检测EGFR突变和ALK/ROS1融合，其结果用于指导靶向治疗。我们通过影像学检查评估药物疗效。所有患者均检测到MPE肿瘤细胞。在活检样本、处理过的MPE和未处理过的MPE中检测到EGFR突变和ALK/ROS1重排。我们发现经处理过的MPE比活检或未经处理的MPE具有更高的敏感性和特异性。26例EGFR-TKI治疗的患者中，13例部分缓解（PR），7例(进展)PD，6例（稳定）SD。在接受ALK/ROS1抑制剂的16名患者中，8例PR，4例PD，4例SD。本研究为NSCLC中MPE肿瘤细胞的分析提供了一种新的、低侵袭性、高重复性的方法，有助于精准医学和基因检测。