SpoT在幽门螺杆菌生物膜形成中的调控机制研究

Biofilm is one of important adaptive living way of Helicobacter pylori ( H.pylori ) during its survival and propagation. However, the formation mechanism of H.pylori biofilm is still poorly understood. Our previous work has confirmed that serum starvation can induce biofilm formation of H.pylori. SpoT is involved in biofilm formation of a variety of bacteria and has been found play an important role in the strigent response of H.pylori to serum starvation. But the concrete regulatory mechanism is not clear. Thus we associate that SpoT may contribute to the regulation of H.pylori biofilm formation. Based on the above analysis, we constructed the SpoT mutant strain of H.pylori. In order to find proteins regulated by SpoT in the biofilm formation of H.pylori under serum starvation, comparative proteome analysis will be used to compare the proteomic profile of the biofilm in the wild-type H.pylori and the SpoT mutant. The function of key proteins discovered will be identified on molecular and animal level. This work will be useful for the identification of new pathogenic factors and curative value against H.pylori and will provide new thinking for the prevention and treatment of this pathogenic bacteria.

生物膜是幽门螺杆菌（H.pylori）生存及传播过程中的一种重要适应性生存方式，目前关于H.pylori生物膜的形成机制仍知之甚少。我们的前期工作证实血清饥饿可诱导H.pylori生物膜的形成，SpoT参与多种细菌生物膜的形成，并有研究报道SpoT在H.pylori应对血清饥饿严谨应答中起重要作用，但其具体作用机制不明确，由此我们推测SpoT在H.pylori生物膜形成中发挥调控作用。因此，我们构建了SpoT基因缺失突变株，拟利用蛋白质组学筛选H.pylori野生株和SpoT突变株形成生物膜后的差异蛋白质，寻找生物膜形成过程中受SpoT调控的蛋白质分子，并在分子水平和动物水平对筛选出的关键蛋白进行体内外功能验证，分析SpoT在H.pylori生物膜形成中的调控机制，将有助于揭示H.pylori抗逆生存机制和发现新的致病因子及抗菌靶位，旨在为H.pylori的预防与治疗提供新思路。

生物膜是幽门螺杆菌（H.pylori）生存及传播过程中的一种重要适应性生存方式，目前关于H.pylori生物膜的形成机制仍知之甚少。SpoT参与多种细菌生物膜的形成，并有研究报道SpoT在H.pylori应对严谨应答中起重要作用，但其具体作用机制不明确。本研究首先通过RT-PCR和P32标定方法验证了SpoT及其表达产物ppGpp在H.pylori 生物膜状态下表达明显降低，扫描电子显微镜和共聚焦显微镜观察发现SpoT突变株形成的生物膜中细菌结合不够紧密，生物膜基质不完整较疏松，并可见较多空洞，证实了SpoT参与H.pylori生物膜的形成。.生物膜是导致细菌多重耐药的一个重要因素，因此我们比较了H.pylori野生株与SpoT突变株在浮游状态和生物膜状态下对8种抗菌药物的敏感性，结果显示两种生物状态下SpoT突变株对抗生素的敏感性均明显高于野生株，这表明SpoT参与H.pylori的耐药。基于SpoT参与H.pylori生物膜形成与耐药，而外排泵在细菌生物膜形成与耐药过程中具有重要作用，我们推测SpoT可能通过调控外排泵相关基因的表达实现以上功能，通过测定H33342荧光强度积累比较了野生株与SpoT突变株的外排能力，证实SpoT突变株外排能力低于野生株，这暗示SpoT可以调控外排泵相关基因的表达。RT-PCR筛选结果显示SpoT突变株中Hp1174基因表达明显降低，该基因编码葡萄糖转运蛋白（GluP）。同时抗生素诱导试验显示阿莫西林与甲硝唑在野生株中均可诱导Hp1174表达，并呈现时间与浓度依赖，而在SpoT突变株Hp1174几乎不能被诱导，初步认为SpoT可能通过调控Hp1174参与H.pylori生物膜形成与多重耐药。.采用同源重组方法构建了H.pylori26695的Hp1174缺失突变株，扫描电子显微镜和共聚焦显微镜观察同样发现Hp1174突变株形成的生物膜细菌结合不够紧密，生物膜基质不完整较疏松，并且Hp1174突变株对抗生素的敏感性均明显高于H.pylori野生株。以上数据表明GluP参与H.pylori生物膜形成及抗生素耐药并通过SpoT调控。本课题的研究成果，对于明确H.pylori的抗逆生存机制及传播规律具有重要意义，可为H.pylori的治疗与预防提供崭新的途径。.