siRNA沉默蛋白酶体β亚基基因诱导小鼠年龄相关性黄斑变性及其分子机制的研究

年龄相关性黄斑变性(AMD)是引起严重视力损伤的主要眼疾。已发现视网膜色素上皮（RPE）细胞衰老与20S蛋白酶体有密切关系，特异性抑制20S蛋白酶体功能可诱导年轻RPE细胞出现不可逆的衰老表型，因此20S蛋白酶体很可能通过调节RPE细胞衰老参与AMD的发病。本课题拟对原代培养人RPE细胞中20S蛋白酶体的三种活性亚基的表达进行调控，通过检测细胞衰老指标 (细胞形态、活性、β半乳糖苷酶活性和自发荧光水平)、荧光蛋白质底物法测定细胞内20S蛋白酶体活性、定量分析细胞内氧化蛋白质和几种与AMD发病密切相关的细胞因子(VEGF、MCP-1和Apo-E)水平，分析各亚基对人RPE细胞衰老和细胞功能的影响效应；构建沉默敏感β亚基的siRNA-rAAV载体，小鼠视网膜下注射后检测视网膜-脉络膜的形态、电生理功能及组织病理变化，明确此动物模型的病理学特征。此项研究将为AMD的深入研究提供重要依据。

年龄相关性黄斑变性(AMD)是全球范围内引起老年人严重视力损伤的主要眼疾。AMD的发病原因和具体机制仍不明确，目前临床治疗的效果也十分有限。近年来的研究发现，具有多种催化降解功能的酶类复合物蛋白酶体，对细胞、机体的老化进程以及多种年龄相关性疾病的发生具有重要的调节效应。我们的前期工作提示，蛋白酶体是对RPE细胞衰老具有高度敏感性的直接调控因素，可能在AMD等年龄相关性眼疾的发病中扮演关键角色，其发挥效应的途径至少包括氧化蛋白质清除和细胞因子调节两个方面。但相关研究国内外均尚未见于报道。因此我们提出本课题的基本设想，即通过调节蛋白酶体特异性亚基功能诱导RPE衰老和AMD样病变，进而阐明蛋白酶体在AMD发病和防治中的角色和应用潜能。. 经本项目的研究工作，我们得到了如下结论: 1）首次发现蛋白酶体β5亚基的功能对RPE细胞衰老具有显著影响效应；2）首次证明特异性沉默蛋白酶体β5亚基可诱导人RPE细胞出现典型衰老表型，可作为衰老研究的细胞模型；3）首次揭示了蛋白酶体β5亚基功能与RPE细胞内氧化应激压力直接相关，是RPE氧化应激损伤的潜在机制之一，可作为氧化压力调控的靶点；4）首次将蛋白酶体功能与RPE细胞分泌功能相联系，证实β5亚基沉默诱导RPE细胞产生促炎症因子MCP-1、促血管生成因子VEGF和载脂蛋白ApoE。以上证据提示：蛋白酶体β5亚基功能通过多重机制影响RPE的功能，对RPE衰老和AMD的发病具有关键性作用，具有成为AMD临床的防治靶点的潜力。. 在本课题原定工作计划中，还包括了蛋白酶体β5亚基在RPE细胞中过表达对细胞衰老表型和疾病相关因子的影响效应以及针对蛋白酶体β5亚基的siRNA-rAAV经小鼠视网膜下注射后的相应体内研究。遗憾的是，受客观实验进程和时间、经费限制，在目前完成的工作中，这两部分内容未能够获得有明确意义的数据，仍待进一步实验探索。