miRNA在中国鲎胚胎发育中的表达分析

miRNAs（microRNAs）是在多细胞生物中普遍存在的一类小分子非编码RNA，能够通过与靶mRNA特异性碱基配对引起靶mRNA的降解或者抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控。无论在低等的线虫还是在高等的哺乳动物中,miRNA都起着通过调控基因表达，从而在动物的发生、生长、发育和分化等方面起重要作用。本项目采用Solexa测序技术，结合生物信息学分析、实时定量PCR及原位杂交等分子生物学手段克隆和鉴定与中国鲎胚胎发育各阶段相关的miRNA基因，研究miRNA在不同胚胎发育阶段、不同胚层、不同组织器官的时空表达谱，确定一些与各胚胎发育阶段和组织分化相关的关键miRNA，对一些重要的miRNA的靶基因进行初步预测和分析，阐述miRNA调控中国鲎胚胎发育的分子机制。为中国鲎人工繁殖、调控胚胎发育提供新的思路。

中国鲎是珍稀濒危水生节肢动物，也是动物界屈指可数的活化石动物，其幼体和最古老的节肢动物三叶虫非常相似，因此鲎在节肢动物的系统发育研究占有一席之地。中国鲎胚胎发育过程已经研究清楚，但胚胎发育调控的分子机理缺乏研究。本研究旨在挖掘中国鲎胚胎发育组织分化过程中重要的miRNA，揭示中国鲎胚胎发育调控的机理，为miRNA代谢机制的深入研究提供基础资料，同时为阐明中国鲎胚胎发育的滞育和解滞育的调控机理提供新的思路。.本研究以中国鲎为实验材料，模拟野外中国鲎繁殖的生态习性和环境条件，使亲鲎在实验室条件下配对和产卵。取处于胚胎发育阶段组织分化期的第一次胚内蜕皮期（Tt01）、第二次胚内蜕皮期（Tt02）、第三次胚内蜕皮期（WT03）和快速生长期（第四次胚内蜕皮期）（WT04）的胚胎，采用solexa技术进行高通量小RNA测序。测序片段去除3’接头序列、测序碱基长度小于15 nt和大于26nt的序列和垃圾序列后，进行Rfam数据库和重复序列去除。最后把所有的片段进行注释分类，找到中国鲎胚胎发育4个阶段中所有的miRNA，构建4个阶段的表达谱，进行表达差异分析和保守性分析。对未知的miRNA进行预测分析，包括二级结构预测，表达差异分析和靶基因预测，然后进行GO功能注释和KEGG通路分析。运用实时荧光定量RT-PCR技术对部分miRNA进行实验验证，以此验证solexa测序结果的可靠性。. 4个胚胎发育阶段共发掘出4944个miRNA，其中21条miRNA在其他29种节肢动物中可找到，序列相同（保守序列）；251条miRNA在其他节肢动物种可找到相似的miRNA（碱基不匹配数小于3）；而4672条miRNA是在中国鲎种新发现的。推测一些重要的miRNA与中国鲎胚胎发育组织分化有关，分别是miR-375、miR-184、miR-7、let-7、miR-92a、miR-2a、miR-133、miR-34，其中miR-375与组织生长有关，miR-184和miR-7与组织分化有关，let-7与胚胎后期发育成三叶虫幼体有关，miR-92与血管生成有关，miR-2a与胚胎细胞凋亡有关，miR-133与胚胎中骨骼肌细胞分化有关, miR-34与未分化细胞生长和迁移有关。