基于宽场显微荧光成像技术的一氧化氮亚硝基化修饰对激活的嗜中性粒细胞质钙调节机制的研究

As the first line of host defense against invasion of pathogenic microbes, neutrophils play a crucial role in a variety of inflammatory responses. In generally, researchers have known that there are two main states for neutrophils: resting and activation. Our previous work reported that nitric oxide (NO), a new super "star molecule" of organism, could induce store-operated calcium entry through (SOCE) via s-nitrosylation modification in activation-dependent human neutrophils. In this proposal, we intend to investigate the detailed mechanism of NO on cytosolic calcium via s-nitrosylation modification in activated neutrophils based on wide-field fluorescence microscopy. The main content of this studies occurs as follows: clarifying the signal transduction pathways of s-nitrosylation modification-induced SOCE in activated human neutrophils; achieving simultaneous imaging of calcium and hydrogen & high speed two-channel ratio imaging of calcium in activated neurtrophils; acquiring fast spatiotemporal information of s-nitrosylation modification-induced SOCE in activated neutrophils; understanding the crucial points of s-nitrosylation modification-induced SOCE in activated neutrophils which is different to that of resting neutrophils. This study on modulation of neutrophils calcium by exogenous NO might be much more useful in the research of coronary circulation disease associated with activated neutrophils.

嗜中性粒细胞是机体抵御外界病原侵入的第一道防线，在各种免疫反应过程中发挥着重要作用。研究表明其一般具有静息和激活两种状态。我们已报道一氧化氮（Nitric Oxide,NO）作为生物体内著名的"明星分子"可通过巯基亚硝基化修饰方式诱导激活的人嗜中性粒细胞钙库控制的钙内流（Store-operated Calcium Entry,SOCE）。本项目拟采用宽场显微荧光成像技术，研究NO亚硝基化修饰对激活的人嗜中性粒细胞钙的详细调节机制：阐明NO亚硝基修饰诱导激活的嗜中性粒细胞SOCE 过程的信号转导通路；实现胞质钙荧光双通道快速比率成像和胞质钙、氢离子双通道同步监测；有效获取NO亚硝基化修饰诱导的SOCE 过程快速时空偶联信息；揭示激活与静息态的嗜中性粒细胞质钙对NO亚硝基修饰不同响应的关键机制。本研究可为临床NO治疗嗜中性粒细胞激活导致的冠脉循环堵塞等疾病提供有效的实验支持和新的思考视角。

嗜中性粒细胞是机体免疫系统第一道防线，一氧化氮（Nitric Oxide, NO）对其趋化、吞噬、凋亡、呼吸爆发等生理功能的行使有重要影响。我们已发现NO可通过巯基亚硝基化修饰方式诱导细胞内IP3受体敏感的钙库释放，并引起胞外Ca2+内流，整个过程依赖佛波酯诱导嗜中性粒细胞的呼吸爆发。本项目采用宽场显微荧光成像技术和微操作技术，深入研究了NO亚硝基化修饰对激活的人嗜中性粒细胞钙调节机制及其他相关内容。我们首先利用无Ca2+的HBSS缓冲液对嗜中性粒细胞实现了体外长时间静息保存，可为后续实验开展提供有力的保障。摸索出Fluo-3/4 AM钙荧光探针合适的负载方式，使其可真实、有效的表征胞内钙离子快速时空信息。同时，研究了温度对Fluo-3 AM探针在贴壁细胞负载效果的影响，发现在4℃负载和20℃酶切条件下，胞浆区钙荧光强度明显低于的核区；而在37℃负载和37℃酶切条件下，胞浆区钙荧光强度则显著高于核区，该结果为研究诸如嗜中性粒细胞这样易贴壁细胞不同区域钙信号提供了一种可控的实验方法。我们对作常规的玻璃微针进行封闭、磨光、弯曲处理，并摸索出一套合理的下针方式，成功实现对嗜中性粒细胞进行机械力微局域刺激并捕获到胞内Ca2+波时空传播信息。利用该刺激方式我们在BV2细胞中第一次观察到通道纳米管类似物连接介导的胞间Ca2+波传播。同时，基于饱和虹吸现象，我们成功实现微局部加药刺激，并诱导嗜中性粒细胞定向爬行以及捕捉到钙信号时空成像信息。依靠FMLP/NO对比实验、药理抑制实验和紫外辐照实验，发现NO亚硝基化靶点为G蛋白/G蛋白偶联受体，通过磷脂酶C-IP3通路引起钙库释放，钙内流通道为TRPC类通道。基于荧光光谱仪技术，在群体细胞水平研究了的巯基修饰对嗜中性粒细胞钙信号的影响，发现巯基烷化剂NEM可以引起悬浮的静息或激活态嗜中性粒细胞内Ca2+升高，但是NO却无类似效果，有别于在贴壁的激活嗜中性粒细胞中结果，说明巯基修饰引起的钙升高不仅与细胞状态相关，还依赖于细胞形态和巯基修饰方式。嗜中性粒细胞可释放NO等多种细胞因子，与骨质疏松类疾病有一定关联。我们实验发现NO可通过亚硝基化修饰方式激活成骨细胞TRPV1通道引起胞外Ca2+内流，导致胞内Ca2+升高，最终引起细胞凋亡，可为研究骨质疏松等疾病提供新的观察视角。