靶向性血管生成剂tPep-VEGF-B的分子构建及其在胰岛素抵抗中的作用研究

Insulin resistance (IR) plays a crucial role in the development and progression of type-2 diabetes. Therapeutics to alleviate IR without significant side effects in clinic, however, has not yet been developed. The objective of this project is to design, screen and eventually obtain an engineered angiogenic protein which is capable of alleviating IR in type-2 diabetes. First, employing the methods of computer-aided molecule design and using VEGF-B and targeted peptide, design a series of chimeric proteins which can target adipose tissues and have high affinities toward the receptor of VEGF-B; second, using the methods of linker engineering, optimize the structure of the linkers to further improve their affinities and meanwhile to reduce or eliminate their potential immunogenicity and toxicity; third, evaluate the efficacy of the selected engineered protein in animal models and elucidate its underlying mechanism. This project will not only provide a lead for alleviating IR in type-2 diabetes and developing novel anti-metabolic sydrome drugs, but also shed light on the design and development of other targeting proteins. Most importantly, the success of this project will provide direct experimental support for the theory that modulation of angiogenesis plays a key role in the treatments of metabolic diseases.

胰岛素抵抗是2型糖尿病发生发展的重要环节，但目前临床上尚无能够显著改善胰岛素抵抗且不造成明显副作用的药物。本项目拟根据胰岛素抵抗的发病机理进行重组蛋白质分子合理化设计，以获得能够逆转胰岛素抵抗，治疗2型糖尿病的靶向性血管生成剂。首先，根据文献报道和计算机模拟设计靶向肽，以VEGF-B为效应分子，对融合蛋白进行同源模建、分子对接，目的在于使所得融合蛋白对相应受体具有较高亲和力且对脂肪组织内皮细胞具有较高靶向性；其次，根据柔性刚性、侧链结构等对融合蛋白的接头结构进行优化设计，目的在于使最终分子在保留生物学活性的同时不产生免疫原性甚至分子毒性；然后，在筛选获得目标分子后进行体内生物学活性研究和作用机制分析。本项目的顺利完成不仅可以获得逆转胰岛素抵抗治疗2型糖尿病等代谢疾病的新型药用分子，还可以为其它靶向性蛋白的设计开发提供借鉴，更重要的是将为阐明血管生成调节在代谢疾病治疗中的作用提供实验支持。

血管内皮生长因子B（VEGF-B）是血管内皮生长因子家族成员之一，研究表明VEGF-B可调节内皮细胞脂肪酸摄取，参与脂质代谢调控。本课题设计制备一种靶向白色脂肪组织的新型血管内皮生长因子（tPep-VEGF-B），对其体内外生物学活性进行研究，并初步探讨其改善胰岛素抵抗的可能作用机制。通过分子克隆将tPep-VEGF-B基因构建至pET-28a表达载体并导入大肠杆菌表达体系，优化表达条件和纯化条件，获得高纯度的目的蛋白。经Western Blot、PMF、MALDI-TOF法鉴定表明融合蛋白结构正确，为后续实验提供物质基础；体内外实验证实tPep-VEGF-B具有促进血管生成活性同时具有脂清除活性；利用高脂饮食诱导肥胖小鼠模型证实tPep-VEGF-B可降低小鼠体重，显著改善脂代谢，同时具有改善糖耐量、胰岛素耐量和丙酮酸耐量的作用，提示tPep-VEGF-B可能具有改善胰岛素抵抗的作用；通过炎症因子及相关通路检测推测tPep-VEGF-B通过增加白色脂肪组织血管生成，改善白色脂肪组织缺氧状态，从而降低炎症反应，减轻炎症因子对胰岛素信号通路的干扰，提示tPep-VEGF-B可改善胰岛素抵抗。本研究为2型糖尿病等代谢疾病的治疗提供可能的先导分子，并为血管生成调节剂在代谢疾病治疗中的应用提供了实验依据。以上研究成果发表SCI论文3篇，申请中国发明专利1项，完成了预期研究目标和考核指标。