核酸适配体-纳米金磁微粒复合探针对ARMS-PCR产物捕获及MTHFR C677T基因分型层析检测新方法研究

For the sake of prenatal and postnatal care, as well as prevention and control of chronic disease (such as stroke), it is very important to screen the specific SNP of high-risk population. The genotype of the key enzyme, 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase, in folate metabolism pathway is closely related to cardia-cerebrovascular disease and birth defects. Thus, it is desiderated to develop a new genotyping technique which is simple, accurate and universal compared with NGS, mass spectrum and biochip. In this project, we plan to establish a novel aptamers-GoldMag particle probe through the investigation of the interaction between the aptamers and gold magnetic particles. The investigation of the conformation of aptamers as well as the key factor of affinity capacity of aptamers and Digoxin labelled PCR products will be carried out for the capture of allele specific PCR products. The combination of this aptamers/GoldMag particles complex with lateral flow assay device could be used in the genotype of 677 locus of methylenetetrahydrofolate reductase. A rapid, convenient, accurate and universal genotype method for detection of MTHFR C677T polymorphism will be established by using genome DNA, whole blood as samples, and the clinical study will be carried out as well. The outcomes of this project will contribute to the development of new way for gene screening.

对于优生优育或慢性疾病（如脑卒中）的防控，以特定基因对高危人群筛查意义重大。叶酸代谢通路中的关键代谢酶5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）的基因型与心脑血管疾病、新生儿出生缺陷等发生密切相关。相比NGS、质谱、生物芯片等，普适准确的基因分型新技术亟需。本项目通过研究核酸适配体与纳米金磁微粒的偶联方法，旨在构建新型核酸适配体-纳米金磁微粒复合探针，研究适配体的构像及其与标记PCR产物末端地高辛亲和结合的关键技术，对等位基因特异性PCR产物的捕获条件进行优化，并结合金磁微粒层析装置实现MTHFR C677T位点的基因分型。拟通过基因组DNA、全血等样本对MTHFR C677T基因分型的系统，建立快速、便捷，准确、普适的基因检测新方法，并开展方法学临床对照研究，为基因筛查方法提供新路径。

单核苷酸多态性SNP作为重要的生物标志物在精准医疗领域发挥着重要作用，通过基因型判读可帮助医生为患者给予合理剂量、更加适合的处方药，实现精准、高效、安全的诊断及治疗。因而，建立快速、便捷、准确的基因检测方法可满足个性化用药对新技术的需求。.本项目包括以下研究：（1）建立用于SNP检测的全血直扩PCR体系，通过样本处理液的筛选，使全血样本直接作为模板进行PCR反应。（2）建立了单通道T-ARMS-PCR-金磁微粒层析法技术，以全血或DNA为模板，利用引物的不同标记系统，与层析装置相结合，实现在单管内进行双重PCR扩增，在单个层析条上进行亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR C677T、MTHFR A1298C和甲硫氨酸合成酶还原酶MTRR A66G基因检测。该方法不仅可以用于SNP检测，还可以用于插入/缺失检测。（3）以地高辛小分子为靶标进行SELEX筛选，明确地高辛适配体构型形成的控制因素，得到亲和力高的地高辛适配体。（4）开展了病例-对照试验，对陕西省汉族缺血性脑卒中患者（IS）的MTHFR C677T、MTHFRA1298C和MTRR A66G基因多态性进行检测，并就其与高同型半胱氨酸（HHcy）及IS的关联性进行分析，为IS的早期预防与诊断提供临床参考。（5）进一步建立基于金磁微粒层析体系的甲基化特异性侧向流层析系统及LAMP-金磁微粒层析法，为DNA甲基化生物标志物的检测提供了更快速便捷的方法。.在项目执行期间，发表了相关SCI论文10篇。申请人在全国体外诊断会议报告6次，课题组成员参加国内国际学术会议15人次，分会场报告2次。项目实施期间，培养博士研究生4名，硕士研究生11人。结合2003年度获批国家自然科学基金项目支持，团队奠定了较好的成果转化基础，并且已经在国家药监局取得产品注册证书。