决定古菌DHH家族磷酸酯水解酶底物特异性的结构研究

As the key protein of nucleic acid metabolism, nuclease is involved in many kinds of nucleic acid metabolic reactions and is very important to maintain the stability of DNA and the metabolic balance of RNA. DHH superfamily phosphoesterase is a major hydrolase that hydrolyze phosphodiester and phosphoester bonds. They participate in DNA repair, RNA degradation and maturation, and nucleoside signal molecular degradation. The substrates of each subgroup are very different, including single stranded DNA, RNA and nucleoside analogues. Even for oligonucleotide substrates, there are differences in hydrolysis direction, substrate length and ribose selectivity. We found that archaea encode a number of RecJ nucleases with opposite direction of hydrolysis, NanoRNase and pApase with different substrate spectra. At present, the knowledge of structure and function of DHH phosphatase in archaea needs to be deepened, especially their structural basis for determining substrate specificity. In order to answer the above questions, this project aims to further understand the catalytic mechanism and function division of the various kinds of DHH phosphatase, such as RecJ, NanoRNase, pApase, and so on, by solving the cryatal structure and characterizing the enzymatic characteristics. The expected results will deepen our understanding about the structure and function of archaea DHH phosphatase and the molecular evolutionary relationship among each member.

核酸酶参与多种核酸代谢反应，对维持基因组稳定性、RNA代谢平衡至关重要。其中DHH磷酸酯酶超家族是水解磷酸单酯键与二酯键的一大类水解酶，参与DNA修复、RNA与核苷类信号分子降解等。各类DHH磷酸酯酶的底物差异巨大，包括单链DNA、RNA、核苷酸衍生物等。即使核酸底物也存在水解方向、底物长度、核糖选择性的不同。我们发现古菌编码多个水解方向相反的RecJ核酸酶、底物谱不同的NanoRNase（Nrn）、pApase。目前对古菌各类DHH磷酸酯酶的三维结构与代谢功能方面的认识急待加强，特别是它们决定底物特异性的结构基础。为了回答上述问题，本项目旨在通过解析蛋白结构、酶学生化等研究手段，进一步认识嗜热古菌RecJ、Nrn、pApase等各类DHH磷酸酯酶的催化机理、底物特异性决定机制、功能分工等。预期结果能够加深认识古菌各类DHH磷酸酯酶的结构功能异同，及各成员的进化起源与亲缘关系。

核酸酶参与多种核酸代谢反应，对维持DNA的稳定性与RNA的代谢平衡至关重要。其中DHH超家族磷酸酯酶是水解磷酸单酯键与单酯键的一大类水解酶，参与DNA修复、RNA与核苷类信号分子降解代谢等。各亚类成员的底物差异巨大，包括单链DNA、RNA、核苷类似物等。即使对寡核苷酸底物也存在水解方向、底物长度、核糖选择性的不同。我们发现古菌编码多个水解方向相反的RecJ核酸酶、底物谱不同的NanoRNase、pApase。.为了阐明古菌各类DHH磷酸酯酶的结构功能，特别是它们决定底物特异性的结构基础。本项目通过解析蛋白结构、鉴定酶学特征等研究手段，解析古菌RecJ、NanoRNase、PAPase等各类DHH磷酸酯酶的催化机理、功能分工等科学问题。.取得的重要成果主要包括：（1）阐明了嗜热古菌M .janaschii编码的两个水解方向相反的RecJ核酸酶的水解机制；（2）阐明了嗜热古菌P.yayanosii编码的pApase水解pAp为AMP和磷酸根的催化机制；（3）鉴定了嗜热古菌A.pernix的Nrn核酸酶水解单链DNA和RNA，及pAp和c-di-AMP的酶学特征。.同时基于项目执行过程中的一些非预期性发现，开展了一些项目之外的拓展性研究。主要包括：（1）M .janaschii的DNA复制型解螺旋酶的组成与功能研究，该研究将阐明古菌M .janaschii在染色体复制中独特的DNA解链机制；（2）阐明了古菌核苷酸类第二信使分子的合成与分解机制研究，为后期古菌的核苷酸类信号分子的功能研究打下了良好基础。.项目培养了多名研究生，相关结果发表了多篇研究论文，目前正在整理未发表结果，投稿发表SCI论文。研究结果加深了对古菌DHH磷酸酯酶的结构功能，及各成员间的分子进化关系的认知。理论方面进一步认识了古菌核苷酸和核酸代谢的机制与生物功能；应用方面为蛋白功能的定向体外进化提供了理论依据和重要实例。