低密度脂蛋白主动氧化的识别机制及其氧化环境的建立

AS是心血管系统最常见的疾病。 OX-LDL在AS的发生和发展过程中起着重要的作用。而且LDL一旦被氧化，无论被巨噬细胞摄取与否都会表现出强烈的致AS效应， 因此，AS的抗氧化研究就势在必行。然而LDL在体内的氧化机制目前尚不甚明瞭，这可能是一些在体外具有明显抗LDL氧化作用的抗氧化剂而在临床上未能奏效的内在原因。并不是所有的LDL都需要氧化，事实上也并不是所有的LDL都接受了氧化，据此我们提出了体内LDL氧化的主动与被动之分:被动氧化为随机氧化；而主动氧化可能是体内免疫机制的主动识别过程。本课题的目的就在于利用前面已经结题的两个课题所建立的研究体系，探讨LDL主动氧化过程中可能存在的识别机制以及为屏蔽体内还原系统而由脂质筏建立的氧化微环境的相关分子机制，以期阐明参与LDL氧化的具体生物化学过程，为临床动脉粥样硬化的防治提供新的思路并奠定坚实的实验基础。

1、OX-LDL在AS发生与发展过程中扮演重要角色，但是细胞介导的LDL氧化机制未被阐明。为了进一步了解LDL氧化的机制，本研究揭示天然LDL是否诱导脂质筏的形成。天然LDL刺激细胞后，共聚焦显微镜下显示MPO与天然LDL在细胞膜上存在共定位，但是在methyl-β-cyclodextrin 存在的情况下，这种共定位现象不能形成，同时脂质筏破坏者 MβCD and filipin 降低了MDA的生成。密度梯度超速离心分离脂质筏，对天然LDL诱导前后的细胞蛋白质进行定量蛋白质组分析，共鉴定蛋白质1449个，其中203个蛋白质显著上调。功能聚类分析显示转位蛋白上调显著。这将为LDL氧化机制的研究提供新的视角。.2、为了研究Raw264.7细胞经低密度脂蛋白（LDL）诱导后脂质筏中脂类物质是否发生变化，蔗糖梯度超速离心得到对照组和实验组细胞中的脂质筏，气相色谱质谱（GC-MS）分析脂质筏中脂肪酸的变化；化学衍生脂质筏标志物-单唾液酸四己糖神经节苷脂（Ganglioside 1，GM1），高效液相色谱（HPLC）分析GM1的变化；胆固醇试剂盒测试脂质筏中胆固醇含量的变化。结果表明与对照组相比，经LDL诱导的Raw264.7细胞脂质筏中的单不饱和脂肪酸（MUFAs）组分中十六烯酸、油酸、二十四烯酸显著升高；多不饱和脂肪酸（PUFAs）组分中亚油酸、花生四烯酸和二十碳三烯酸显著降低；饱和脂肪酸组分中棕榈酸和硬脂酸显著升高，十四烷酸和二十烷酸含量无变化；说明LDL改变了细胞脂质筏的脂肪酸微环境。GM1含量和胆固醇含量均显著增高，有统计学意义。数据提示，Raw264.7细胞脂质筏中的脂类物质可能与LDL氧化有关，有利于我们进一步研究LDL氧化过程中脂类物质的作用及其与蛋白质的相互作用。