内皮细胞抑制结核杆菌胞内繁殖的机制研究

Tuberculosis remains a major global health problem on human and animals. The key factor for Mycobacterium tuberculosis (Mtb) pathogenesis is its intracellular survival and replication. We firstly found that brain microvascular endothelial cells (BMECs) inhibit intracellular replication of Mtb, but the mechanism is poorly understood. In this study, we will use the experimental resources and platform in State Key Laboratory of Agricultural Microbiology to explain the difference of Mtb survival and replication in different host cell lines; Construction of stable autophagy expression cell line by CRISPR/Cas9, and live cell imaging, confocal microscopy and super resolution optical microscopy will help to explore the cellular mechanisms of BMECs inhibiting Mtb intracellular replication. Meanwhile, we will analyze the gene expression profile from different cell lines infected with Mtb, especially the genes involved in innate immunity. The key genes will be replaced or changed between different cells to explain the molecular mechanisms of BMECs inhibiting Mtb intracellular replication. This study aims to find the key genes involved in inhibiting Mtb intracellular replication by host cells, and that will provide the target to new anti-mycobacterium drug design.

结核病是世界上威胁人和动物健康的主要细菌性疾病。在细胞内长期存活并繁殖是结核杆菌致病的关键。我们首次发现脑微血管内皮细胞能抑制结核杆菌胞内繁殖，但其机制仍不清楚。本研究将利用农业微生物国家重点实验室多年来在结核杆菌研究中积累的资源和实验平台，明确结核杆菌在两种细胞的存活和繁殖差异；再利用CRISPR/Cas9构建稳定自噬报告系统细胞系，结合活细胞成像、共聚焦显微成像和超分辨成像等技术探索内皮细胞抑制结核杆菌繁殖的细胞生物学机制。同时，我们也将分析两种细胞在结核杆菌感染前后基因表达差异，尤其是与天然免疫相关通路的基因表达差异。通过过表达/沉默或互换不同细胞中关键基因以期从分子生物学的层面揭示内皮细胞抑制结核杆菌胞内繁殖的机制。本研究旨在找到宿主细胞抑制结核杆菌繁殖的关键基因，为开发新型结核药物提供靶点。

由结核杆菌感染引起结核病是世界上危害人和动物健康的主要细菌性疾病。作为胞内寄生菌，结核杆菌可以感染多种细胞，如巨噬细胞、上皮细胞和内皮细胞等。为了成功在寄主细胞内存活，结核杆菌进化出了一系列的策略逃逸宿主免疫清除。我们前期的研究发现，脑微血管内皮细胞可以抑制结核杆菌在细胞内的繁殖，但机制并不清楚。本研究利用现代分子生物学技术、显微成像技术探索内皮细胞抑制结核杆菌胞内繁殖的分子机制，并取得了一些发现：（1）结核杆菌感染不同细胞后其在细胞内的命运不同。结核杆菌在人巨噬细胞和上皮细胞中可以很好的繁殖，而在人脑微血管内皮细胞和鼠巨噬细胞及鼠脑微血管内皮细胞中则不能实现很好的繁殖，但可以长期存活；（2）不同的细胞将结核杆菌递送到吞噬体的不同阶段。结核杆菌抑制巨噬细胞早期吞噬体向晚期的成熟，而上皮细胞和内皮细胞则停滞在晚期吞噬体；（3）不同细胞自噬发生情况有所差异。在脑微血管内皮细胞中，结核杆菌被递送到自噬-溶酶体进行降解；（4）不同细胞溶酶体酸化有所差异。鼠脑微血管内皮细胞溶酶体发生酸化从而清除结核杆菌，而其它几种细胞溶酶体酸化则被结核杆菌抑制；（5）不同细胞的转录普不同。感染结核杆菌后，我们检测了不同细胞的基因表达谱，发现在吞噬体、溶酶体、自噬体通路及IFN诱导基因表达等方面几种细胞的基因表达差异有所差异，比如ITG3在鼠脑微血管内皮细胞中特异性上调表达，而人脑微血管内皮细胞中PLA2R2则显著性上调，OASL在THP1特异性上调表达；（6）OASL参与调控结核杆菌胞内繁殖。OASL具有抗病毒活性，我们发现该蛋白在结核杆菌感染的几种细胞中的表达不同。通过western blot证实结核杆菌感染后oasl基因的表达显著性增强，利用慢病毒包装技术干扰oasl基因的表达后发现结核杆菌的胞内存活能力显著性下降，说明OASL参与调控结核杆菌在细胞内的繁殖。