抑制胰蛋白酶活性的双功能抗菌肽与生物膜的作用机制研究

存在于无指盘臭蛙皮肤里的蛙皮短肽ORB兼具广谱抗菌活性和抑制胰蛋白酶水解活性的双重功能，有望突破天然抗菌肽易被胰蛋白酶样蛋白酶水解的缺陷，在解决细菌耐药性方面具有广阔应用前景。本项目旨在研究蛙皮肽ORB的抗菌机制，拟系统而深入地研究蛙皮肽ORB及与其氨基酸残基序列相近但抗菌活性不同的同系列衍生短肽（总称ORB系列短肽）与细胞膜相互作用进而获得抗菌效果的详细信息。计划采用磷脂囊模拟细菌细胞膜，利用同步辐射X-射线小角散射技术，表征ORB系列短肽与磷脂膜之间作用形成的自组装复合物的结构，并结合其他实验方法，从磷脂膜的物理特性与短肽自身结构这两个层面，考查短肽与细胞膜相互作用的详细信息、以及影响短肽与细胞膜相互作用的关键因素，揭示ORB系列短肽的抗菌机制。深入理解蛙皮肽ORB及其衍生抗菌短肽的抗菌机制，既能为蛙皮肽的临床应用提供理论依据，又有利于新型抗菌药的研发。

存在于无指盘臭蛙皮肤里的蛙皮肽ORB 兼具广谱抗菌活性和抑制胰蛋白酶水解活性的双重功能，有望突破天然抗菌肽易被胰蛋白酶样蛋白酶水解的缺陷，在解决细菌抗药性方面具有广阔应用前景。本项目以蛙皮肽ORB-1和它的一个无活性的衍生肽ORB-N构成研究体系，将同步辐射X-射线小角散射等物理表征方法与生物活性测试相结合，研究蛙皮肽的抗菌作用机制。我们发现ORB-1与ORB-N破坏细胞磷脂膜完整性的能力与它们的抗菌活性和溶血毒性具有很强的关联性：有抗菌活性的ORB-1能够破坏细菌细胞磷脂膜的完整性、并在膜内生成负曲率，而没有活性的ORB-N则既不能破坏膜的完整性、也不能在膜内生成负曲率；无溶血毒性的这两个多肽都不能破坏血红细胞磷脂膜的完整性、也不能再血红细胞磷脂膜内产生负曲率。这一结果显示，蛙皮肽ORB-1很可能是通过在细菌磷脂膜内生成富含负曲率的离子通道，从而破坏磷脂膜的完整性、发挥抗菌作用。关于磷脂膜的相关重要物理特性各自对蛙皮肽与磷脂膜之间的相互作用的影响，还在进一步的完善与深化中。同时，针对蛙皮肽的“构-效”关系，我们采用了仿抗菌肽高分子作为先期研究对象，并将研究结果与文献中已有的天然抗菌肽的结果作比较，发现它们的破坏细菌细胞膜稳定性的作用机制具有较高的相似性；两者都是通过在细菌细胞磷脂膜内产生负曲率来破坏膜的稳定性，而且它们共有的两亲性和阳离子性这两个结构特点均有助于膜破坏过程。基于这一结果，我们设计制备了由环境pH控制抗菌分子是否具有正电性，从而在酸性条件下具有抗菌活性、但在正常生理pH环境对细菌和宿主细胞均无毒性的“环境刺激响应型”抗菌分子。该实验结果，也为正电性在抗菌肽及其类似物的抗菌活性中的重要作用提供了直接的实验依据。基于这些前期基础，我们计划在进一步工作中回归蛙皮肽体系，深入研究蛙皮肽这一特殊抗菌肽的“构-效”关系的特点。