放线菌Hb-2中植物防御素RsAFP2机制类物的鉴定及合成调控机理分析

Plant defensin RsAFP2 from radish has been demonstrated to target fungal specific glucosylceramide and thus have low toxicity to humans and plants.If some antifungal compounds with mode of action similar to RsAFP2 could be found in microorganisms and produced in large scale by fermentation, choices of eco-friendly managements of plant fungal diseases will be increased. Based on the unique antifungal feature that antifungal substances targeting glucosylceramide fail to inhibit the fungal strains lacking capability to synthesize glucosylceramide, we created a method for selectively screening the antifungal compounds with the antifungal mechanism similar to RsAFP2. As a result, we found that a Streptomycese sp. strain Hb-2 produces antifungal metabolites with mode of action similar to plant defensin RsAFP2. Our preliminary study showed that seed treatment with the secondary metabolites of Hb-2 could increase the survival rate of wheat seedlings in the soil with the fungal pathogen Bipolaris sorokiniana.We propose to identify the corresponding antifungal compound targeting fungal glucosylceramide from Hb-2. Based on the genome sequence,we will identify the gene cluster for its biosynthesis and investigate the regulatory mechanism of biosynthesis.

植物防御素在植物抵御病原真菌入侵过程中起着非常关键的作用。植物防御素RsAFP2以真菌特异糖苷神经酰胺为作用靶标，具有对人和植物无毒的优点，但难以实现其规模化生产和应用。 从微生物中筛选作用机制类似于RsAFP2的天然抗真菌物质、并通过发酵实现其规模化生产，将为植物真菌病害防控提供低毒、环保新型杀菌剂。根据作用于糖苷神经酰胺活性物质对野生型构巢曲霉与糖苷神经酰胺合成缺陷型突变体抑菌作用的差异，申请人课题组建立了以真菌特异糖苷神经酰胺为靶标的微生物源抗真菌物质筛选方法，并筛选获得了放线菌Hb-2菌株，其代谢产物的抑菌特点和植物防御素RsAFP2类似。初步研究发现，用Hb-2代谢产物处理种子，可以提高小麦在含有小麦根腐病菌土壤中的出苗率。本研究拟从Hb-2中分离作用于糖苷神经酰胺的抗真菌物质，鉴定其化学结构，明确其合成基因，确定调控其合成的转录因子及调控机制。

菌株Hb-2是我们从海洋污泥中筛选得到的产生抗真菌物质的放线菌，具有广谱的抗真菌活性和应用潜力。本项目旨在从Hb-2中分离抗真菌物质，鉴定其化学结构，明确其合成基因，确定调控其合成的转录因子及调控机制，我们按计划完成了项目的研究目标。通过分析链霉菌Hb-2（后来经测序鉴定为微白黄链霉菌W68）产生的抗真菌物质，我们分离到了4个抗真菌活性物质，其中1个经鉴定为β-丙胺胆酸。基因组测序结果显示微白黄链霉菌W68拥有一条大小约为6.79 Mb的线性基因组。anti-SMASH分析发现W68基因组含有21个可能参与合成次级代谢产物的基因簇。通过分析每个基因簇中重要基因的结构和转录，我们发现其中10个可能与抗真菌次级代谢产物的合成相关。这10个基因簇中关键基因，我们均进行了敲除，发现在敲除了基因簇19中的ctg1-5755基因后菌株丧失了部分抗真菌活性。随后，通过差异转录表达谱分析，我们解析了ctg1-5755基因调控次级代谢产物合成的机理。基因ctg1-5755的敲除在链霉菌发酵培养40 h和60 h时影响的主要生物学过程有代谢过程、细胞过程以及定位。ctg1-5755敲除突变体与野生型菌株相比，有30个与次级代谢产物合成相关的基因差异表达。因此ctg1-5755主要通过影响这30个与次级代谢合成相关的基因表达而导致敲除突变株丧失了部分抗真菌活性。以上研究加深了对微白黄链霉菌W68抗真菌活性物质及其合成调控机理的认识，为其进一步开发应用奠定了基础。