南方根结线虫巨噬细胞移动抑制因子抵御植物免疫反应的机理研究

南方根结线虫是专性内寄生植物线虫，可寄生近千种植物，据估计，全世界因根结线虫危害造成的损失多达500亿美元，被称作最具破坏性的植物病原物，目前在我国成为蔬菜等经济作物的主要病害之一，仍缺乏安全有效防治措施。研究表明，人体寄生虫如丝虫、钩虫和疟原虫均发现与人体巨噬细胞移动抑制因子（MIF）有较高同源性的类MIF，其作用是通过模拟人体MIF使其逃避人体的免疫保护而建立长期寄生关系。我们已获得了南方根结线虫的MIF基因，拟利用原位杂交、Western blot、发育表达模式分析、酵母双杂交、免疫共沉淀和RNAi及植物突变体等技术和方法，明确其表达虫态和表达部位；测定其酶活性并获得植物与其互作的蛋白；明确该基因在寄生过程中抵抗植物免疫反应的作用。结果将为阐明植物寄生线虫逃避植物免疫反应的机理提供新线索，为研究植物源MIF的功能提供新思路，为寻找防治南方根结线虫新靶标并制定防治新策略提供理论依据。

南方根结线虫是专性内寄生植物病原线虫，可寄生近2000种植物，据估计，全世界因根结线虫危害造成的损失多达500亿美元，被称作世界上最具破坏性的植物病原物，目前仍缺乏安全有效的防治措施。研究表明，人体寄生虫如丝虫、钩虫和疟原虫均发现与人体巨噬细胞移动抑制因子（MIF）有较高同源性的类MIF，其作用是通过模拟人体MIF使其逃避人体的免疫保护而建立长期寄生关系。我们克隆了南方根结线虫的巨噬细胞移动抑制因子MIF基因，发现了3种不同MIF基因，分别命名为Mi-AMIF， Mi-BMIF和Mi-CMIF；研究了MIF在南方根结线虫不同虫态中的发育表达模式，表明在J2、侵染后的J2和J3幼虫中有明显上升趋势；利用原位杂交技术，确定MIF基因的组织表达部位为线虫体壁；瞬时表达MiMIF蛋白表明其主要定位于洋葱表皮细胞的细胞质、细胞膜等部位；构建了Mi-AMIF, Mi-BMIF和Mi-CMIF原核表达载体，进行了菌体诱导表达，分离纯化得到Mi-BMIF、Mi-CMIF蛋白，制备了Mi-BMIF抗体；通过农杆菌介导蘸花法，获得了MIF基因在拟南芥中的超表达T3代纯合株系以及含BMIF序列1-329bp作为RNAi干扰片段的RNAi转基因拟南芥T2纯合植株；线虫侵染试验表明，超表达BMIF基因的拟南芥植株明显降低了对南方根结线虫的敏感性，但不影响根内线虫发育；RNAi转基因拟南芥T2代纯合植株其根内线虫雌成虫数量明显减少；胁迫条件下，拟南芥BMIF超表达株系和RNAi干扰株系种子的萌发滞后于野生型，但最终各株系拟南芥种子均能萌发；进行了MIF基因酵母双杂交实验，经初步筛选，得到30来个阳性克隆，正在验证中。以上结果表明MIF基因在线虫建立寄生关系中起重要作用，为阐明南方根结线虫逃避植物免疫反应的机理提供了新线索，为寻找防治南方根结线虫新靶标提供了依据。在项目执行期间，《设施蔬菜根结线虫病综合治理技术研究与应用》获得了北京市科技进步二等奖，项目主持人排名第2，申请发明专利2项，其中1项即将获得授权，发表SCI文章3篇，主译并出版了《植物线虫学》专著1部，还主办了首届中美植物寄生线虫综合治理学术研讨会，参会人员80人左右，凝聚了一支研究队伍，培养了研究根结线虫的博士后1名、研究生6名，其中1名博士和2名硕士已获得学位，另外2名博士和1名硕士在读。综合上述，我们已完成了项目的各项指标。