miR-9参与CREB-REST通路调控BDNF表达在OPTN（E50K)突变致RGCs凋亡的机制研究

OPTN is the POAG related gene, and the mutant E50K OPTN downregulates the expression of BDNF via CREB pathway, induces the apoptosis of RGCs, thus contributes to glaucoma, while the mechanism is still unclear. Given miR-9 regulating REST to alter the expression of BDNF in the CREB pathway, and it is highly related to OPTN in the miRNA analysis, our research is to overexpress and inhibit miR-9 in the vitro and vivo mutant E50K OPTN transgenic models to observe that mutant E50K OPTN whether alters CREB-REST pathway regulating expression of BDNF via impacting the level of miR-9, and induces the RGC apoptosis, in order to clarify the effect of miR-9 in the mutant E50K OPTN contributing to glaucoma, and seek the glaucoma related miRNA, provide new molecular marker for early diagnosis and drug target point for treatment, and establish the foundation for gene therapy of glaucoma.

OPTN基因是POAG的致病基因。OPTN( E50K)突变可以通过CREB通路下调BDNF的表达，进而诱发RGCs凋亡，导致青光眼的发生，但具体机制不清。在CREB通路中miR-9通过调节REST影响BDNF的表达；基因相关miRNA分析：miR-9与OPTN具有极高相关性。本研究拟利用已建立的体内外OPTN((E50K)突变转基因模型，过表达或抑制miR-9，观察OPTN(E50K)突变能否通过影响miR-9的表达水平进而影响CREB-REST通路调控BDNF表达及这种作用是否参与了OPTN（E50K）突变导致的RGC凋亡，阐明miR-9在OPTN（E50K）突变导致的青光眼中的作用，探寻与青光眼发病有关的miRNA，为临床早期诊断青光眼提供新的分子标志和药物治疗靶点；为青光眼基因治疗奠定基础。

我们在前期研究工作基础上，在已建立的OPTN(WT)与OPTN(E50K)瞬时转染RGC细胞模型及转基因小鼠模型中，应用real-time PCR及Western Blot检测mir-9及p-CREB、REST、OPTN、BDNF转录及表达水平，并应用细胞及组织免疫荧光技术检测各种蛋白在细胞内的定位及表达情况，并对于RGC细胞凋亡情况进行分析。.下面就以上各方面开展的研究工作做详细的汇报。.1）在OPTN(WT)与OPTN(E50K)瞬时转染RGC细胞模型中，real-time PCR及Western Blot检测mir-9及p-CREB、REST、OPTN、BDNF转录及表达水平，结果显示，突变型细胞中，miR-9较野生型表达量低，OPTN、REST水平相对较高，p-CREB、BDNF相对较低，细胞凋亡略增加。.2）在OPTNWT与OPTNE50K转基因鼠模型中，real-time PCR及Western Blot检测mir-9及p-CREB、REST、OPTN、BDNF转录及表达水平，结果显示，突变型转基因小鼠模型中，miR-9较野生型表达量低，OPTN、REST水平相对较高，p-CREB、BDNF相对较低，视网膜神经节细胞数减少。.3）在野生型体内外模型中，过表达或抑制miR-9，检测到p-CREB-REST通路调节BDNF表达的活性呈现相应的变化，RGC的存活也出现相应的差异。.以上研究工作证实，OPTN（E50K）基因突变模型中，突变蛋白产生可以与miR-9的活性调节酶进行互作的异构体，从而使得mir-9水平降低，并且通过下调抑制REST的程度，而减低BDNF表达，增加RGC凋亡，致青光眼发生，为OPTN基因突变导致POAG分子生物学机制提供了新的证据，进一步为青光眼的早期诊断及基因治疗提供了良好的研究基础，为临床治疗青光眼提供新的策略和治疗靶点，并对推进该疾病的研究具有重要意义。