RIP3调控TRAIL诱导的膀胱癌细胞程序性坏死和凋亡的分子机制研究

Necrosis can be induced by stimulating death receptors with tumor necrosis factor (TNF) or other agonists. Protein kinase receptor-interacting protein 3 (RIP3) as a molecular switch between TNF-induced apoptosis and necrosis. We identified the tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) is a member of the TNF gene superfamily that induces apoptosis upon engagement of cognate death receptors. Death receptor 5 (DR5, also named TRAIL-R2) locates at the cell surface, becomes activated or oligomerized upon binding to its ligand TRAIL or overexpression, and then signals apoptosis through caspase-8-mediated rapid activation of caspase cascades. While TRAIL is relatively non-toxic to normal cells, it can selectively induce apoptosis in many types of transformed cells. Nevertheless, some human bladder cancer cells are particularly resistant to the effects of TRAIL. The signaling mechanism of TRAIL induced cell death in resistant human cancer cells remains unclear. In this current study, we will seek to identify the functional roles of RIP3 on the TRAIL induced necroptosis and apoptosis in bladder cancer cells by use of specific over-expression of RIP3 and RIP3 deficient human bladder cancer cell models. From this research, we will suggest that modulation of RIP3 in response to TRAIL has an important role in the choice between apoptosis and necrosis for treatment of resistant human bladder cancer cells.

受体相互作用蛋白3（Receptor-Interacting Protein3，RIP3）是丝/苏氨酸蛋白激酶家族成员之一,在肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）诱导的细胞凋亡与坏死途径中发挥重要作用。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL)是近年新发现的抗肿瘤药物。本课题组前期研究发现：TRAIL与死亡受体结合可选择性的诱导多种肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无明显的杀伤作用。但相当一部分肿瘤细胞,特别是膀胱癌细胞表现出对TRAIL的原发性或继发性耐药，其确切分子机制还不清楚。本研究将确认酸性条件下TRAIL诱导的膀胱癌程序性细胞坏死作用机制，拟构建RIP3基因过表达和RIP3基因敲除的膀胱癌细胞模型，明确RIP3对TRAIL诱导的程序性坏死和凋亡相互转换的分子机制，为TRAIL耐药性膀胱癌的临床治疗提供一种新的用药模式和理论依据。

本课题组前期设计、合成了多种新的化合物，并利用一些肿瘤细胞株（如BIU87，MGC803)进行了初步的活性测定，发现Jaspine B类化合物YJF-14对膀胱癌细胞BIU87敏感，查尔酮化合物H72和S17、丁烯内酯类化合物Z-1以及Jaspine B衍生物LHM对胃癌细胞MGC803较为敏感。我们的实验结果表明，YJF-14作用于膀胱癌BIU87细胞，一方面可以降低线粒体膜电位下调Bcl2和Bcl-xl的表达激活线粒体凋亡途径。另一方面通过激活JNK通路，促使Beclin1-Bcl2和Beclin1-Bcl-xl复合体解聚诱导自噬，上调自噬蛋白Beclin1、LC3、ATG5等，而且JNK又激活P62-keap1/nrf2途径，诱导保护性自噬来拮抗凋亡。另外，YJF-14下调NQO1的表达，抑制BIU87细胞的迁移。LHM作用于胃癌细胞MGC803后，下调Bcl2家族蛋白，进而诱导Beclin1表达升高，促进自噬流的发生，增加P62的表达，诱导细胞发生缺陷型自噬作用，并且LHM激活RIP3磷酸化，诱导RIP3-RIP1坏死体形成，促进RIP3下游靶蛋白MLKL磷酸化。另外，引入RIP3敲除的MGC803细胞模型能够较好的逆转LHM的细胞自噬和程序性坏死作用以及一些蛋白的变化。H72、S17和Z-1处理MGC803后，可诱导产生活性氧，导致caspase9/3和线粒体膜电位的变化，并且H72、S17和Z-1可通过上调DR5、DR4及BimEL, 下调Bid, Bcl-XL和XIAP蛋白诱导癌细胞的凋亡。另外，活性氧抑制剂N-acetyl cysteine (NAC)较好的逆转了H72、S17和Z-1的细胞凋亡作用及一些蛋白的变化。在利用裸鼠的体内实验结果显示，H72、S17、Z-1和LHM在不影响体重变化的情况下，都能够明显地抑制了肿瘤的生长。这些结果表明，这些化合物在体内外效果良好、作用机制明确，为开发抗前列腺癌和抗胃癌新药提供理论依据。