磷酸化修饰在双微体形成中的功能以及作为肿瘤治疗靶点的研究

双微体作为基因扩增的细胞遗传学标志物，常常与肿瘤的恶性进展及耐药性的产生密切相关。虽然双微体的产生机制还未完全阐明，但DNA双链断裂修复系统在其中发挥重要作用。为明确双微体产生过程中磷酸化修饰的功能以及作用靶点，本研究采用对DNA双链断裂修复过程中相关激酶及特异性磷酸酶表达文库筛查方法，寻找影响肿瘤细胞中双微体扩增的蛋白激酶及磷酸酶。利用MYC报告基因表达细胞进行初筛，生物学功能验证后，再针对所获的靶分子采用高通量为基础的激酶和磷酸酶活性筛查方法，从中药有效成分数据库中寻找明显作用于目的分子的中药分子。对这些有效成分进行抗肿瘤表型验证后，我们将获得若干抗肿瘤表型作用明显、抑癌机制清晰的，具有应用于临床肿瘤治疗潜能的中药分子。这必将为中药制剂广泛应用于临床肿瘤治疗开辟崭新的道路。

双微体作为基因扩增的细胞遗传学标志物，常常与肿瘤的恶性进展及耐药性的产生密切相关。虽然双微体的产生机制还未完全阐明，但DNA双链断裂修复系统在其中发挥重要作用。为获得双微体产生过程中磷酸化修饰的功能以及作用靶点，本研究以DNA双链断裂修复过程中的磷酸化与去磷酸化过程为研究对象，寻找参与肿瘤细胞双微体形成的主要信号分子，并对其作为双微体阳性肿瘤治疗靶点可行性进行评估。一方面，应用基因沉默技术，对DNA双链断裂修复的两个主要途径非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）途径的主要信号分子进行阻断，检测通路阻断后细胞内双微体变化情况，结果显示NHEJ和HR任一通路的阻断，都可以引起细胞内双微体数目的减少。进一步的研究显示，细胞内双微体一部分转变为均质染色区（HSR），另一部分以微核形式排到细胞外。另一方面，通过特异性丝/苏氨酸磷酸酶表达文库筛查，以MYC报告基因作为检测对象，确认参与肿瘤细胞双微体形成的磷酸酶。经过进一步的生物学验证，获得3个促进细胞内双微体形成的磷酸酶PPM1A，PPM1G和PTEN，以及3个抑制细胞内双微体形成的磷酸酶PP2Ca，PP2Cb和Wip1。接下来，检测所获得信号分子在含双微体肿瘤细胞中的生物学功能，结果显示，基因沉默NHEJ和HR途径主要分子后，肿瘤细胞增殖也受到明显抑制；值得注意的是，抑癌基因PTEN和PPM1A沉默后，细胞内双微体形成受到抑制，但细胞增殖却得到了增强，提示双微体上所携带的癌基因存在转录或翻译水平的调节。通过以上研究，我们基本明确了DNA双链断裂修复（NHEJ和HR）途径的主要激酶在双微体形成过程中发挥重要作用，而这个过程同时受到多个磷酸酶的调节。这为以这些信号分子作为双微体阳性肿瘤治疗靶点奠定了理论基础。