抗苯磺隆播娘蒿中代谢抗性相关基因鉴定、克隆与功能分析

The increased metabolic activities of cytochrome P450 monooxygenase (P450), glutathione S-transferase (GST), glycosyl transferase (GT) and peroxidase (POD) are the most important metabolism-based resistance mechanisms in weeds. The mechanisms of metabolism-based resistance are complex and remain poorly understood, while the target-site-based resistance mechanisms (e.g. target site-gene mutation) can be precisely determined and are mostly well known. This proposed project aims to: ①identify differently expressed genes (DEGs) between susceptible and resistant flixweed (Descurainia Sophia L.) biotypes using RNA sequencing technologies, ② determine the expression levels of DEGs in susceptible and resistant biotypes and select the candidate genes, ③clone the full length cDNA of candidate genes by 3’- or 5’- RACE, ④express cDNA in yeast and transform it into Arabidopsis thaliana, in order to characterize the function of candidate genes. This research will greatly help us to understand the non-target-site based mechanisms and the rules of resistance evolution. In addition, we will understand the roles of these super families （P450/GST/GT/POD） in the evolution of herbicide resistance.

细胞色素P450酶（P450）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST)）、糖基转移酶（GT）和过氧化物酶（POD）等代谢酶活性增强是杂草对除草剂产生抗性（代谢抗性）的重要机理。由于代谢抗性机理复杂，人们了解甚少；而靶标位点抗性机理（例如靶标位点基因突变）易精准检测，相关研究报道较多。本项目研究主要内容：①利用RNA测序技术，对在敏感和抗性播娘蒿中差异表达的代谢基因（例如P450、GST、GT、POD）进行鉴定；②利用RT-qPCR技术，验证差异基因在敏感和抗性播娘蒿中的表达水平，并选定候选基因；③利用3'或5'-RACE技术，克隆候选基因全长cDNA；④将候选基因在酵母中表达并在拟南芥中进行遗传转化，对候选基因功能进行分析。研究结果有助于全面理解非靶标位点抗性机理和杂草抗性进化规律；深刻认识P450、GST、GT和POD等超基因家族酶系在除草剂抗性进化中的作用。

本研究利用LC-MS/MS技术，测定了抗性和敏感播娘蒿对苯磺隆的代谢差异，为证明播娘蒿对苯磺隆的抗性与代谢作用增强密切相关提供了直接证据。与此同时，利用RNA-seq技术和qRT-PCR技术，从抗苯磺隆播娘蒿中鉴定出多种与抗苯磺隆代谢和抗性高度相关的代谢酶基因，这些代谢酶基因主要包括：11个细胞色素P450（P450）基因，3个ABC-转运蛋白（ABC-transporter）基因， 5个谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione S-transferase， GST）基因，16个糖基转移酶（glycosyltransferase， GT）基因和2个过氧化酶（peroxidas，POD）基因。其中5个全新P450基因（CYP96A146、CYP96A147、CYP77B34、CYP709B8、CYP81F5）获得P450命名委员会命名。为了进一步研究对苯磺隆的代谢作用及在抗性进化中的功能，将从抗苯磺隆杂草中鉴定、筛选出来的P450 (CYP96A146和CYP96A147)在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中进行异源表达。研究结果表明，两个P450不仅对苯磺隆表现出了较强的代谢作用，而且在播娘蒿对苯磺隆的代谢抗性中发挥着重要作用。. 代谢抗性的最大威胁是导致草对具有不同作用机理的除草剂产生交互抗性，从而使通过轮用或混用不同作用机理的除草剂来延缓抗性发展的策略失效。由于代谢抗性的多样性和复杂性，杂草代谢抗性机理的研究并不多。因此，对杂草代谢酶基因进行鉴定和分析，对于揭示杂草的抗性机理和代谢酶的基因利用具有重要意义。