玉米抗纹枯病相关miRNA的克隆及其功能分析

玉米纹枯病是一种土传性真菌病害，近年来该病蔓延速度加快，发生面积不断扩大，危害日趋严重，逐渐成为我国玉米产区的主要病害，严重影响玉米产量和品质性状的提高。包括病害在内的逆境胁迫是作物生长和产量提高的重要限制性因素之一，大量研究正试图揭示这一复杂的生物学机制。miRNA作为小分子RNA(Small RNA)中的一个重要类群，同时作为新层次的基因表达调控因子越来越引起人们的关注。本项目在前期研究的基础上，利用Real-time PCR 和组织原位杂交技术对分离筛选的16条miRNAs分子进行抗病功能表达分析；利用miRNAs靶基因生物信息学预测软件和RACE克隆技术，鉴定并克隆获得miRNAs的靶基因，并利用荧光素酶报告基因检测系统对靶基因进行功能验证；从而鉴定在玉米抗真菌病害胁迫过程中起关键作用的miRNA，为阐明玉米抗纹枯病基因调控的分子机理奠定基础。

miRNA是一类内源性的、21~25碱基长度的小分子非编码RNA，它通过指导剪切或者抑制翻译等方式调节植物基因的表达，参与调控植物生长发育和逆境胁迫响应等各个方面。因此，筛选重要抗病相关玉米miRNA及其靶基因并鉴定其功能，深入研究候选miRNA及其靶基因在抗病基因表达调控过程中的作用是必须的，更是紧迫的。本项目选取耐纹枯病玉米自交系R15和高感纹枯病玉米自交系掖478为材料，利用Solexa深度测序与生物信息学手段分析，筛选获得大量玉米纹枯病胁迫相关miRNA，结合miRNA原位杂交、miRNA荧光定量和半定量等方法对重要抗纹枯病相关miRNA及其靶基因进行表达检测，取得的主要成果如下：共获得39个新miRNA，分属于33个miRNA家族，其中处理中特有新miRNA为5个，对照中特有新miRNA为15个，处理和对照中共有且发生差异表达的新miRNA共15个，处理和对照中共有但无明显差异表达的新miRNA共4个；获得147个已知miRNA，分属于25个miRNA家族，其中发生显著或极显著差异表达的已知miRNA共41个，发生显著差异表达的成熟miRNA有4个，极显著差异上调表达的miRNA为2个，极显著差异下调表达的miRNA共35个。候选miRNA的靶基因在两材料R15和掖478中的表达检测结果表明，其靶向作用的AGO1蛋白、GRAS转录因子、泛素水解酶、TCP转录因子、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、漆酶、ARF激素响应因子1/2、谷胱甘肽硫转移酶、MFS药物转运蛋白、转运蛋白和CCAAT转录因子等均能在两材料接菌后处理中被检测，并且表达差异较大。从总体水平来看，受下调表达miRNA调控的靶基因在两个材料接菌后不同时间段中其表达量呈上调趋势，且在胁迫后24 h增至最高，而受上调表达miRNA调控的部分靶基因在两个材料接菌后不同时间段中其表达量有下降趋势。.通过本项目的资助，已发表SCI收录论文论文4篇，累计影响因子11.7，中文重要核心期刊论文6篇，一般国际期刊1篇；申报国家发明专利1项，实用新型专利2项；培养博士研究生1名，硕士研究生2名。