OBP6在双委夜蛾卵受精过程中的生物学功能研究

Athetis dissimilis Hampson is an important agricultural insect pest newly found in mainland China in recent years. It causes a great loss to crop yields, especially to corn and wheat. However, it is rarely studied on A. dissimilis. Our previous study found A. dissimilis OBP6 (odorant-binding protein 6) gene was high expressed in the testes of male moth, and that the expression quantity was twenty times higher than in antennae. Most studies reporded OBPs is mainly found in the lymph of antennal sensillum with the functions of binding and transportation. OBP genes expressing in reproductive organ of male moth are been little study. Its function is unclear at present. In this study, we explore the expression profiles and rules of A. dissimilis OBP6 gene from both sides of mRNA and protein, meanwhile the acting sites of this protein is located through immunohistochemistry. Then we use the technology of CRISPR/Cas9 to knockout OBP6 gene, and filter mutations to study the function of Athetis dissimilis OBP6 gene in the process of egg fertilization. It will enrich the function of odorant-binding protein genes and provide new method for geen control technologies.

双委夜蛾Athetis dissimilis是近年在中国大陆新发现的一种重要农业害虫，对农作物产量造成极大的损失，尤其对玉米为害严重，但目前国内外对双委夜蛾的研究较薄弱。本项目组前期研究发现双委夜蛾OBP6（odorant-binding protein 6）在雄蛾的精巢中大量表达，其表达量是在触角中表达量的20倍。大多数研究认为OBPs主要存在于触角感器淋巴液中起结合和运输功能，而对雄虫生殖系统内大量表达的OBPs功能研究极少，目前此类基因功能尚不清楚。本研究拟从mRNA水平和蛋白质水平探讨双委夜蛾OBP6的表达谱及表达规律，同时采用免疫组织化学方法，对该蛋白的作用部位进行跟踪定位；然后采用CRISPR/Cas9技术，敲除OBP6基因，筛选出缺失个体，通过解剖和行为学试验，探讨双委夜蛾OBP6基因在卵受精过程中的作用，丰富气味结合蛋白基因的功能，同时也为研究新型绿色防控技术提供理论参考。

近些年，对气味结合蛋白的研究较多，该蛋白主要分布在昆虫触角感器的淋巴液中。外界环境中的气味经过触角上的感器孔进入，气味结合蛋白开始识别和结合，然后将气味分子转运到位于触角感觉神经原膜上的嗅觉受体，受体识别后产生电神经冲动，昆虫做出相应的行为反应。但后来有研究发现，气味结合蛋白不仅存在于嗅觉器官中在非嗅觉器官中也有发现，推测气味结合蛋白可能具有不同的生理功能。我们也发现双委夜蛾OBP6在精巢中大量表达，因此本项目对OBP6基因的生理功能进行了研究。..我们主要从三个方面进行研究：1）对双委夜蛾精巢和卵巢进行转录组测序，获得完整的与生殖相关的OBP家族成员；2）利用实时荧光定量PCR技术、Western blot技术和免疫组化对双委夜蛾OBP6在mRNA水平和蛋白水平的表达情况及组织定位；3）对双委夜蛾OBP6基因进行敲除，从解剖和行为学两个角度推断OBP6的生理功能。..我们从双委夜蛾精巢和卵巢的转录组测序中，获得23个OBPs。其中21个OBPs在精巢中高度表达，只有一个OBP50在卵巢中高度表达。从结果中可以看出，双委夜蛾精巢中也有一套与触角类似的OBPs家族成员。荧光定量PCR结果显示，AdisOBP6在双委夜蛾精巢中的表达量远高于在触角中的，在幼虫期的精巢中AdisOBP6就已经开始表达，蛹期表达量低于幼虫期的。成虫羽化后，AdisOBP6在精巢中的表达量逐渐进入高峰。未受精卵和受精卵中AdisOBP6几乎不表达或表达量极低。Western blot检测分析发现，AdisOBP6蛋白主要在精巢中表达，在雌雄成虫触角、受精卵和未受精卵中表达量很低。在幼虫精巢中AdisOBP6蛋白就开始表达一直延续到成虫期，在成虫期精巢AdisOBP6的表达量达到高峰。从免疫组化的定位中可以看出双委夜蛾OBP6蛋白主要存在于精液中。这些结果说明，双委夜蛾OBP6参与了精巢的发育和卵授精的过程。对双委夜蛾OBP6基因进行敲除后，发现雄蛾不交配或者交配后产的卵大多为未受精卵，但具体原因还需要后期多次试验去证实。..本项目的研究初步阐明气味结合蛋白与卵受精之间的关系，同时丰富了气味结合蛋白的生理功能。