大豆主要过敏原蛋白Gly m Bd 28K IgG结合表位的定位研究

Based on bioinformatic analysis of Soybean major allergen Gly m Bd 28K, IgG binding epitopes were analyzed and mapped with genetic engineering, monoclonal antibody technology and peptide synthesis. The main contents include (1) Prokaryotic expression、 refolding and purification of Gly m Bd 28K and Natural soybean protein extraction; (2) Preparation and identification of the monoclonal antibody specific to Gly m Bd 28K; (3) The synthesis of overlapping peptides of Gly mBd 28K; (4) The selection of synthetic peptides specific to monoclonal antibody and identification of IgG binding epitope. It will be provided important theoretical guidance to explore the molecular mechanism of soybean allergy, reveal the nature of an allergic reaction, develope no allergy and hypoallergenic foods research through comprehensive analysis, identification of the Gly m Bd 28K IgG binding epitope spectrum.

本研究在应用生物信息学技术分析Gly m Bd 28K蛋白抗原特性的基础上，应用基因工程技术、单克隆抗体技术和多肽合成技术全面分析和鉴定Gly m Bd 28K蛋白的IgG结合表位。主要研究内容包括（1）原核表达复性和纯化Gly m Bd 28K蛋白及大豆天然蛋白的提取；（2）抗Gly m Bd 28K特异性单克隆抗体的制备和鉴定；（3）全面覆盖Gly m Bd 28K蛋白重叠多肽的合成；（4）合成多肽与特异性抗体的反应性筛选和IgG结合表位鉴定。通过全面分析、鉴定Gly m Bd 28K蛋白的IgG结合抗原表位谱，探明大豆过敏产生的分子机制，揭示过敏反应的本质，对开展无过敏和低过敏的食品研究提供重要的理论指导。

Gly m Bd 28K是大豆的主要过敏原之一，能够诱导人体产生过敏反应，威胁人体健康。目前，关于Gly m Bd 28K的致敏机理报道甚少。因此，本研究通过基因工程技术克隆、表达、纯化出Gly m Bd 28K蛋白，由此制备出Gly m Bd 28K蛋白的多克隆抗体和单克隆抗体。利用DNAStar等生物信息学软件分析Gly m Bd 28K蛋白的一级结构、二级结构，以及Gly m Bd 28K蛋白的亲水性、柔韧性和表面可及性等结构特性，设计合成了34条重叠多肽，覆盖Gly m Bd 28K蛋白的一级结构。合成多肽与BSA偶联后，分别与Gly m Bd 28K多克隆抗体以及抗重组蛋白的单克隆抗体（mAb2D9、mAb3F5和mAb3H6）和抗天然蛋白的单克隆抗体（mAb1E3和mAb2F4）进行Dot-blot试验，初步筛选出三条主要的阳性多肽28(C)GDKKSPKSLFLMSNS42 （G28-S42）、56(C)LKSHGGRIFYRHMHI70（L56-I70）、154(C)ETFQSFYIGGGANSH168（E154-H168）。竞争ELISA结果表明，L56-I70能够抑制mAb3F5与Gly m Bd 28K天然蛋白的结合，半数抑制浓度为60 ng/mL。丙氨酸依次取代L56-I70上的每一位氨基酸，合成突变多肽，并与mAb3F5反应，结果证明F64、Y65 和 R66是L56-I70上三个关键的氨基酸结合位点。为Gly m Bd 28K抗原图谱的绘制以及低过敏食品的开发提供了理论依据。