转染Ang1及VEGF双质粒的胎盘来源间充质干细胞对新生小鼠BPD模型干预研究

支气管肺发育不良（BPD）是早产儿常见的慢性肺部疾病，目前发病机制尚未明确，缺乏有效的防治措施，死亡率和致残率较高。本研究从BPD 存在明显的微血管形成阻滞入手，通过分别构建Ang1和pcDNA3／VEGF165质粒，腺病毒组装转染自体胎盘来源的间充质干细胞后，经颈外静脉输注到新生小鼠支气管肺发育不良模型体内，采用呼吸力学、形态学和免疫组化、分子杂交、电镜等手段观察移植后肺功能、肺泡结构和微血管生成以及VEGF、SP-A、SP-B、SP-C 及TGF 等相关蛋白表达等指标的变化，旨在探讨携带Ang1和VEGF 基因的胎盘来源MSC 对于BPD 血管新生和肺泡化的影响及作用机制，阐明肺损伤中循环受损与肺泡阻滞的关联，为今后BPD 基于细胞基础的基因干预治疗提供实验依据。

支气管肺发育不良（BPD）是早产儿常见的慢性肺病，机制未明且治疗缺乏，死亡率和致残率较高。本研究从微血管发育异常入手，分别构建Ang1和VEGF质粒，慢病毒包装转染MSCs，输注到BPD鼠体内，观察移植后肺泡结构、微血管及相关指标变化，探讨携带Ang1和VEGF 基因的MSC 对BPD 血管新生和肺泡化的影响及机制。成果为：（1）采用Gateway技术成功构建了携带荧光蛋白和目的基因的PLV.Ex2d.P/neo-CMV>VEGF/IRES/EGFP、PLV.Ex3d.P/puro-CMV>Ang-1>IRES/DsRed-Express2及空白质粒PLV.EX2D.p/puro-CMV>DsRed express2、PLV.EX2D.neo-CMV>EGFP，经PCR及测序证实完全正确。（2）成功将目的质粒与辅助质粒pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4及pLV/helper-SL5混合经脂质体法制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，并转染293FT细胞行慢病毒包装，获得高滴度、高感染力的慢病毒颗粒。（3）通过慢病毒介导获得携带VEGF基因和GFP基因及Ang1和DsRed基因的鼠MSCs稳转细胞株，多次传代冻存复苏活力良好，经Q-PCR及Western blot证实可稳定表达VEGF或Ang-1，荧光示踪良好。（4）证实MSCs VEGF及MSCs Ang-1细胞培养上清液均可促进鸡胚尿膜囊新生血管生成，且VEGF和Ang1存在协同作用。（5）采用高氧（70%±5%）诱导，成功制备BPD鼠模型，并用HE染色、免疫组化、血管计数及电镜观察了肺泡结构和微血管发育情况，证实肺循环异常是BPD的重要机制。（6）通过模型鼠的在体实验，显示MSCs、MSCs-Ang-1及MSCs V+A可减轻BPD模型鼠肺损伤和肺循环损害，其中以MSCs V+A效果最为明显，可有效改善BPD模型鼠的体重，提高RAC，增强肺血管生成，减少肺部因高氧导致的炎症反应，减轻肺胶原沉积和纤维化，证实采取VEGF和Ang1双基因通过MSCs导入，可有效的修复受损肺循环，减轻BPD肺损伤，为BPD的有效干预提供了新的思路。本项目已发表基金署名论文7篇，其中论著4篇（其中SCI论文1篇）。此外已投稿4篇。后期估计尚能发表SCI 1- 2篇，国内核心3-5篇。