基于AKT/eNOS信号通路探讨去甲乌药碱干预内皮细胞形成侧支循环的机制研究

The formation, opening and expansion of coronary collateral circulation has been considered as a hot and difficult issue in the field of coronary heart disease research. Endothelial cells activate AKT/eNOS signaling pathway during hypoxia and then promote tube formation with angiogenesis process, which is considered as the primary and core link in the formation of coronary collateral circulation. As a representative of Wen-yang herbs, the mechanism of Aconite on treating coronary heart disease has not been clear. Our previous study found that Higenamine, a water-soluble cardiotonic component of aconite, activated the β2/PI3K/AKT pathway in cardiac myocytes. Now we further found that it also activated the AKT/eNOS pathway in endothelial cells. On these basis, we designed this study: 1) In vitro, the upstream pathway of Higenamine to AKT/eNOS in endothelial cells was investigated by inhibitors and interfering RNA. 2) In vitro, to clarify the effects of Higenamine on the proliferation, migration and apoptosis of endothelial cells. 3) In vivo, the effects on collateral circulation and angiogenesis were studied by ligating the lower extremity artery and retinal neovascularization of mice. In order to enrich the biological basis of Warming Yang therapy for chest arthralgia. Combining the cardioprotective effect of Higenamine in the prophase to develope a new lead compound as a multi-target cardiovascular compound.

冠脉侧支循环的形成、开放、扩张目前是冠心病研究领域的热点和难点问题，内皮细胞在缺氧刺激下激活AKT/eNOS信号通路，进而成管的血管新生过程被认为是冠脉侧支循环形成的首要和核心环节；附子作为温阳药的代表，但其治疗冠心病的作用机制一直未能明确，课题组在前期研究发现附子水溶性强心成分去甲乌药碱（Higenamine）在心肌细胞激活β2/PI3K/AKT通路，进一步发现在内皮细胞，其同样激活AKT/eNOS通路；在此基础上，我们拟研究：1、体外通过抑制剂和干扰RNA方法寻找其在内皮细胞AKT/eNOS的上游通路；2、体外明确Higenamine对内皮细胞增殖、迁移、凋亡的影响；3、体内通过结扎小鼠下肢动脉和小鼠视网膜新生血管形成实验，分别探讨对侧支循环形成和血管新生的作用。以期丰富温阳法治疗胸痹的生物学基础；结合前期去甲乌药碱对心脏的保护作用，开发其作为心血管多靶点作用的先导化合物。

冠状动脉侧支循环是一种冠状动脉粥样硬化疾病发展过程中的代偿状态，常继发于冠状动脉狭窄或血栓形成之后，而血管新生（Angiogenesis）作为其形成的主要核心环节之一，又被认为是侧支循环形成的第一步。水溶性单体去甲乌药碱（Higenamine, Hige）作为附子主要研究单体之一，多项研究发现Hige具有强心、抗血管、抗血小板聚集、抗心律失常、抗心肌凋亡等心血管多靶点作用。然而，Hige在侧支循环领域中的研究尚未见。在此我们采用小鼠股动脉结扎下肢缺血模型，观察给药后下肢血流情况，发现中药组有改善小鼠下肢缺血的趋势。体内通过OIR模型观察小鼠视网膜新生血管情况，在Hige的作用下，小鼠体重较模型组增加；眼球石蜡切片的HE染色结果显示，有部分内皮细胞突破视网膜内界膜向玻璃体腔生长；视网膜铺片荧光染色显示，Hige腹腔注射后可以明显促进小鼠视网膜新生血管的生成，减少无灌注区面积，因此，Hige可以通过刺激内皮细胞出芽生长的方式，促进血管新生，改善缺氧引起的血流问题。体外实验选取HUVECs培养，CCK8实验证明Hige可促进HUVECs的增殖；Boy-den小室法及划痕实验证明Hige可促进HUVECs的迁移；小管形成实验中Hige可促进HUVECs的血管生成；WB结果显示Hige可以在第15和30min时使HUVECs中AKT磷酸化表达上升，在第2、5、15、30min时能使eNOS磷酸化表达上升；ELISA实验中在Hige干预后，细胞上清液中VEGF的含量与Ctr组间相比，其差异无统计学意义；加入PI3K抑制剂（LY294002）、β2特异性受体抑制剂（ICI118551）以及VEGFR2的小分子抑制剂（AZD2171）后重复划痕实验、Boy-den小室法及小管形成实验，其中PI3K抑制剂和VEGFR2的小分子抑制剂可以使Hige促进HUVECs迁移、血管生成的能力被抑制，而β2特异性受体抑制剂对其均无效。因此，我们证明了（1）Hige可能通过VEGFR2/PI3K/AKT/eNOS信号通路促进内皮细胞的增殖、迁移和血管形成，但与VEGF及β2受体不相关；（2）Hige作为附子水溶性碱中的有效成分，在体内外均具有干预血管内皮细胞促进血管新生的作用。