大黄鱼神经肽Y2亚族受体的信号转导机制及其生理功能研究

Food intaking and growth are important traits of aquatic fish, and the research focusing on these traits has great significance. As one of the important factors involved in neuroendocrine system, neuropeptide Y (NPY) achieves its feeding, growth and the related physiological function by acting on neuropeptide Y receptor (NPYR). This project focuses on one of the important economic aquatic animals--large yellow croaker (Larimichthys crocea). Based on the pre-obtained full-length of NPYR-Y2 subfamily (NPY2R/7R) genes, bioactive Lc-NPY and its activation characters on receptors, in vitro expression in HEK293 and L. crocea ovarian cell lines, further research will use molecular and cell biological and physiological techniques to clarify the signal transduction mechanisms presented by cAMP, Ca2+ and MAPK pathways, endocytosis and intracellular transport mechanisms of NPY2R/7R, as well as role of NPY2R/7R in food intaking and growth. This project will essentially help to discover the L. crocea NPY2R/7R signal transduction mechanism and its influences on feeding, growth and other physiological processes. It will promote the research of G protein-coupled receptor (GPCR) in marine biology, enrich the fish neuroendocrine theory and provide the theoretical basis for traditional aquaculture of large yellow croaker.

摄食和生长是经济鱼类的重要生产性状，其生理调控机理研究意义重大。神经肽Y（NPY）作为神经内分泌系统的重要作用因子，通过受体（NPYR）介导，实现其对摄食、生长等生理过程的调控。本项目以大黄鱼为研究对象，在前期获得的大黄鱼神经肽Y2亚族受体（NPY2R/7R）基因序列、NPY活性多肽及其对受体的激活特征分析、人细胞（HEK293）及大黄鱼卵巢细胞表达研究等基础上，采用分子及细胞生物学、生理学等研究手段，揭示大黄鱼NPY2R/7R激活后介导的cAMP、Ca2+和MAPK通路等信号转导机制，NPY2R/7R的内吞和胞内转运机制，探明其在摄食、生长等生理活动中的调控功能。本项目的实施，将有助于阐明和揭示NPY2R/7R信号转导对大黄鱼摄食、生长等生理过程的调控机理，丰富鱼类神经内分泌调控研究理论，推进海洋生物G蛋白偶联受体（GPCR）领域的研究，亦为相关产业技术开发提供参考。

大黄鱼是中国沿海较为常见的高值经济鱼类。但其野外自然资源破坏较为严重，近几十年来主要依靠人工繁育和养殖填补。而大黄鱼的生长相关的特征和性状对于评价其野外生存能力和经济价值都具有重要参考意义。神经肽Y，可以促进摄食，也能刺激生长、生殖相关激素的释放，被视作调节摄食、生长和生殖三者关系的重要协调因子。因此，探明大黄鱼NPY的作用机制，对于研究大黄鱼的摄食、生长的调节机制和进一步提高其经济性状和生理机能，具有重要的科学理论价值。.具体研究结果如下：.1. 成功克隆得到了大黄鱼NPY2R和NPY7R的序列全长，两种受体都是典型的G蛋白偶联受体，具有典型的7次跨膜结构域。通过相似性比对，大黄鱼Y2亚族两个受体的与其他鱼类的神经肽Y2亚族的相似性较高，进化树分析表明大黄鱼NPY2R和NPY7R受体与其他鱼类的Y2亚族聚为一支，与其本身分类地位相符合。.2. 竞争性结合实验表明大黄鱼NPY可以与LcNPY2R和LcNPY7R结合。同时，大黄鱼NPY可以激活LcNPY2R和LcNPY7R，引起胞内第二信使cAMP水平的降低，活化了cAMP/PKA信号通路；另一方面，NPY激活两种受体后，可以检测到胞内钙离子浓度的升高，介导了PLC/IP3/Ca2+ DAG信号通路。LcNPY2R和LcNPY7R被NPY家族多肽激活后介导了MAPK信号通路，且ERK蛋白的活化呈现配体的浓度和时间依赖性。另外，在人HEK293细胞和大黄鱼性腺细胞中，两种受体被激活后都会内吞至细胞内。.3. 实时荧光定量PCR结果证明两种Y2亚族受体主要在大黄鱼消化道中表达较高。配体刺激和RNA干扰实验结果表明，大黄鱼NPY/NPY2R系统可能参与大黄鱼生长的负调控。通过构建大黄鱼NPY真核表达载体，将不同组成的融合表达基金片段插入到pcDNA3.1(+)质粒中，获得具有C端酰胺化等精确修饰的产物多肽，与内源多肽的功能活性达到相同水平。.本项目主要分析和鉴定了大黄鱼Y2亚族两个受体的蛋白结构及活性特征，探讨了NPY/NPYR系统在大黄鱼生长、摄食及生殖控中的功能，建立了大黄鱼GPCR功能蛋白活性鉴定及细胞生物学研究相关的技术方法，为深入研究大黄鱼摄食、生长调控机制提供重要支持和理论参考。