思茅松毛虫核型多角体病毒En-Dk蛋白的功能鉴定及其杀虫机理研究

In a previous study, a nucleopolyhedrovirus from the infected larvae of Dendrolimus kikuchii have been identified as a new virus. Here, we cloned an En-Dk gene from the virus by PCR. The His/En-Dk fusion protein was expressed in Escherichia coli showed high virulence against the larvae of D.kikuchii, Hyphantria cunea and Lymantria dispar..The applicant intends to construct the heterologous AcMNPV recombinant vector with En-Dk gene and explores the mechanism action of En-Dk protein with AcMNPV recombinant virus. Constructing CaMV35S promoter-driven En-Dk gene expression vector, then it is used for tobacco genetic transformation using the leaf disc method, and analysis the resistance to insect in transgenic tobacco. Analysis the proteins expression change of insect digestion tissue in the process of the insect feeding and En-Dk expression level dynamics by protoemics. Combination of microscopic molecular mechanism and the macroscopic appearance resolve the resistance molecular mechanism of En-Dk protein. .Completion of the project provides candidate genes to build the high insecticide efficiency and wide host range in recombinant viruses, and lay foundation for the development of protein pesticide and transgenic breeding to control insects.

申请者以一株新的思茅松毛虫核型多角体病毒为研究材料，通过PCR技术分离到新基因En-Dk，经原核表达后His/En-Dk融合蛋白对松毛虫、美国白蛾和舞毒蛾都具有较高的杀虫活性。. 本项目拟通过构建含有En-Dk基因的异源AcMNPV的重组载体，探索En-Dk蛋白在异源重组病毒中的作用机制；构建CaMV35S启动子驱动的En-Dk基因超表达载体，采用叶盘法进行烟草遗传转化，分析转基因植株对害虫的抗虫活性；利用蛋白组学技术分析害虫取食过程中消化组织结构蛋白表达变化以及En-Dk表达水平动态；结合微观分子机制和宏观表象解析En-Dk蛋白抗虫作用的分子机制。.项目的完成将为构建杀虫效率高、寄主范围广的重组病毒提供候选基因，为蛋白质农药的开发和林木抗虫育种工作奠定基础。

食叶害虫因食性杂、取食量大、传播速度快、易爆发成灾等特点，严重影响林木的生长，导致树势衰弱以及次生性病害虫的发生，严重时可使树木成片死亡。为提供无污染的杀虫蛋白资源，项目研究团队2012-2015年利用基因组学从思茅松毛虫核型多角体病毒（DekiNPV）中分离出新型杀虫蛋白基因En-Dk，通过原核表达和分离纯化后，En-Dk蛋白对春尺蠖、甜菜夜蛾、美国白蛾、舞毒蛾和棉铃虫都具有较高的杀虫活性。为深入研究新型蛋白En-Dk功能和杀虫分子机理，将其构建到AcMNPV杆状病毒异源载体和植物表达载体上。AcMNPV/En-Dk异源表达蛋白在侵染Sf9细胞晚期才开始转录，且在侵染72h时表达含量达到最大。AcMNPV/En-Dk异源表达后对甜菜夜蛾幼虫生长发育具有延缓作用。构建CaMV35S启动子驱动的En-Dk基因超表达载体，采用叶盘法进行烟草遗传转化，研究发现转En-Dk基因的烟草株系的表型表现出：生长速率缓慢，平均始花期推迟25 d。与野生型烟草相比较，转基因烟草叶片对甜菜夜蛾初孵幼虫具有一定的毒杀作用，在喂食12d时，野生型烟草校正死亡率为4.63±5.34%，而转基因株系校正死亡率在53-62%。转基因烟草对甜菜夜蛾3龄幼虫体质量有明显的抑制作用，其En20转基因株系的抑制率为41.63%。与野生型烟草相比较，转基因烟草株系对甜菜夜蛾的蛹质量、化蛹及羽化过程均有一定的抑制作用，野生型烟草喂食试虫的化蛹率和羽化率都在90%以上，而转基因株系En20化蛹率和羽化率分别仅为30.04%和25.5%。上述研究结果表明，En-Dk蛋白可作为蛋白质农药的开发和抗虫育种工作的候选蛋白或基因。此外，在项目的研究过程中，发现另一新的杀虫蛋白DkChi，该蛋白对甜菜夜蛾、美国白蛾、棉铃虫和舞毒蛾3龄幼虫具有强的杀虫活性，其IC50的值分别为192.4, 305.3, 378.9 and 431.7μg/cm2。尽管En-Dk和DkChi杀虫蛋白的功能都已明确，但两者是否具有协同作用，还需要后续项目资助证实。