牛支原体粘附因子的筛选与鉴定

牛支原体（Mycoplasma bovis）是2008年以来我国犊牛肺炎疫情的主要病原之一。牛支原体通过在牛上呼吸道粘膜的拓殖，降低机体抵抗力引起其它病原体的继发感染。进一步的研究发现在牛支原体表面可能存在除Vsps蛋白之外的粘附因子。为了证实这种推测，本研究拟在已经获得的牛支原体中国湖北分离株全基因组序列基础上开展新的粘附因子的筛选和鉴定研究。利用LipoP1.0 Server数据库预测其假定膜蛋白基因有56个，选择其中30个基因利用体外定点突变技术和原核表达系统获得表达产物，通过蛋白酶切及亲和树脂纯化技术得到不含标签蛋白的纯化重组蛋白。制备针对重组蛋白的兔高免血清。采用体外牛气管上皮细胞和胎牛肺细胞吸附与抑制试验、免疫电镜、免疫Blot实验等手段筛选并鉴定新的粘附因子，为进一步研究该病原的致病机制奠定基础。

牛支原体（Mycoplasma bovis）是导致犊牛肺炎的主要病源之一，该病原通过粘附到牛呼吸道上皮细胞并进行拓殖而引起呼吸道疾病。本研究小组在国内首次分离并鉴定了一株牛支原体，命名为Hubei-1。通过对Hubei-1株的全基因组序列分析结果显示，牛支原体基因组大小为948,121bp, G+C 含量为 29.29% ，共有804 开放阅读框架，编码52脂蛋白, 46个分泌蛋白和135个跨膜蛋白；利用蛋白质性质与功能软件分析，推测牛支原体基因组中的52个膜蛋白或跨膜蛋白具有潜在的免疫反应原性，该研究报告已经发表在2011年的Plos One 杂志上。为了开展牛支原体蛋白粘附特性研究，本研究在国内首次建立了利用激光共聚焦技术评价重组蛋白体外粘附牛呼吸道上皮细胞（EBL）和细胞计数法定量评价支原体对模型细胞的粘附效率的实验平台。根据生物信息学分析结果，优先选择30个膜蛋白基因开展了粘附功能和免疫原性特性研究。利用上述技术平台发现了2个与牛支原体免疫相关的蛋白，他们分别是：烯醇化酶和VpmaX；同时也发现了一个与支原体免疫相关基因—P28。通过黏附与黏附抑制试验、细胞膜定位实验，最终证实烯醇化酶和VpmaX是两个存在于牛支原体细胞表面的与粘附功能相关的蛋白。这些研究工作已经通过2篇研究报告的形式分别发表在2012和2013的Plos One 杂志上。在对P32基因功能研究中，我们发现该基因具有良好的免疫原性。利用该蛋白建立的ELISA方法具有良好的敏感性和特异性，通过与商品化试剂盒进行比较结果显示，Kappa为0.812具有较高的符合率。这项工作已经按照农业部申报新兽用生物制品的要求申请了临床试验，并已经与2014年2月获得了批准。. 通过国家自然基金会对“牛支原体粘附因子的筛选与鉴定”项目的资助，使得我国在牛支原体致病机理研究领域处于国际先进水平。在项目执行的3年中，共发表研究报告SCI论文3篇，影响因子大于11；中文核心期刊3篇。自主研发的1个诊断试剂产品已经获得临床批准。