小麦韧皮部发育中功能蛋白和锌离子对筛分子编程性半死亡的调控研究

前期研究证实小麦韧皮部筛分子（SEs）发育经历了一个编程性细胞半死亡过程。本项目利用多学科技术，研究SEs半死亡过程的调控机理。包括：①对细胞核、液泡和线粒体解体的超微结构进行观察，分析与半死亡发生的关系。②观察功能蛋白，如酸性水解酶（Phytepsin）、caspase3-like蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶抑制因子（cystatin）和Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶（Oslyt20）、Zn2+依赖的核酸内切酶（ZEN1）等在SEs发育中的分布动态；同时研究相关基因的差异性表达，以确定它们在SEs半死亡过程中的调控作用。③研究pH（H+）的变化，分析它与细胞器解体关系；④检测SEs中Zn2+分布和含量变化，弄清它是如何影响caspase3-like蛋白酶和核酸内切酶活性，进而参与筛分子编程性半死亡进程控制的。研究成果可丰富植物PCD理论，对调控作物细胞衰老和死亡有重要指导意义。

发育成熟筛分子仍保留有少量细胞器，以活细胞形式存在，用于运输有机养分。前期研究证实小麦韧皮部筛分子（SEs）发育经历了一个编程性细胞半死亡过程。本项目利用多学科技术，研究小麦SEs半死亡过程的调控机理。包括：①利用蛋白双向电泳技术对SEs渗出液进行检测，分析了SEs发育过程中筛管蛋白质变化；②对液泡和细胞核等细胞器的超微结构进行了观察，分析它们与SEs半死亡的关系。③研究了小麦中天冬氨酸蛋白酶（WAP1），半胱氨酸蛋白酶（Caspase-3-like蛋白，TaeMCA 蛋白，组蛋白酶B(Cathepsin B）)，半胱氨酸蛋白酶抑制因子（WCs）和核酸内切酶（BEN1-like 蛋白）在筛分子中的定位和分布，对相关基因表达进行了定量分析，推测了它们在筛分子发育过程中的作用。④对SEs内pH值进行测定，分析了pH值变化对细胞器解体和功能蛋白活性的影响。⑤对SEs内源Zn2+ 的分布与相对含量进行了检测，分析了Zn2+ 变化与上述多种功能蛋白关系和在筛分子发育中的作用。.主要结果如下：①筛分子编程性半死亡中的细胞质降解主要是由液泡介导的微自噬过程，且待液泡里吞噬的细胞质基本降解完全后，液泡膜选择性地与质膜融合，使得部分细胞质被保留。②筛分子在编程性半死亡早期并未出现细胞质酸化，而是在液泡膜与质膜融合时，才出现弱酸性，随后迅速恢复中性，这种pH变化既维持了蛋白酶发挥作用所需的酸性环境，又抑制了天冬氨酸蛋白酶（如WAP1）的活性，保存了部分细胞质；③小麦组蛋白酶B可能参与了筛分子活性的维持；而WAP1作用相反，主要降解筛分子细胞质。这两种蛋白酶作用平衡的结果，导致筛分子发育过程中出现编程性半死亡。④在3 DAF和4 DAF，筛分子编程性半死亡中细胞核降解与BEN1-LIKE蛋白酶高活性密切相关；SEs中內源Zn2+ 的浓度变化趋势 BEN1-LIKELIKE 蛋白酶活性变化同步。因此，內源Zn2+ 的浓度变化可能影响BEN1-LIKE蛋白酶活性，最终使SEs编程性死亡进程没有完整进行。⑤另外，TaeMCAⅡ和WCs可能也参与了小麦筛分子发育的PCD进程。因此，小麦颖果筛分子编程性半死亡发生可能是由液泡，多种蛋白水解酶，蛋白酶抑制因子和Zn2+ 综合作用的结果。上述研究研究成果可丰富植物PCD理论，对调控作物细胞死亡有重要指导意义。