猪源肠球菌LytTR型应答调节蛋白FsrA的功能及作用机制

In-depth understanding of the role played by the two-component regulatory system in the regulation of pathogenicity is essential to the molecular design of the "antivirulence" drug targets, and thus has important theoretical and practical significance. The FsrA protein is the response regulator of FsrC/FsrA two-component regulatory system in enterococci of pig origin, but the target genes it regulates remain unclear except gelE and sprE. In this study, the fsrA gene mutant strain was constructed using the targetron technique.The virulence-related target genes the FsrA protein regulates were investigated through the comparative analysis of the transcriptome between the fsrA gene deletion strain and the wild strain and validated using qRT-PCR in order to elucidate the function of the FsrA protein. Then, the gel mobility shift assay, DNase I footprinting trial and site-directed mutation techniques were performed to determine the binding and binding sites between the FsrA protein and the promoter region of target genes, as well as the key amino acid residues of the FsrA protein in its action to thereby clarify the mechanism of the FsrA protein. These studies will widen the understanding about the function and mechanism of the LytTR-type response regulator FsrA in enterococci of pig origin, so as provide the theoretical foundation to find the novel "antivirulence" drug targets, and also the effective strategy and means for the prevention and control of pathogens.

深入认识双组分调控系统在病原菌致病性调控中的作用，对"抗毒力"药物靶标的分子设计至关重要，因而具有重要的理论价值和实际意义。FsrA是猪源肠球菌FsrC/FsrA双组分调控系统中的应答调节蛋白，但其调控的靶基因除gelE和sprE外，还不清楚。项目拟采用targetron技术构建fsrA基因缺失株，通过对fsrA基因缺失株和野生株的转录组比较分析，挖掘FsrA蛋白调控的致病相关靶基因，并采用qRT-PCR验证，明确FsrA蛋白的功能；然后，通过凝胶迁移率试验、Dnase I足迹试验和定点突变技术确定FsrA蛋白与靶基因启动区的结合及结合位点，以及FsrA蛋白发挥作用的关键氨基酸残基，进而阐明FsrA蛋白调控的作用机制。这些研究可拓宽对猪源肠球菌LytTR型应答调节蛋白FsrA的功能及作用机制认识，从而为寻找新型"抗毒力"药物靶标提供坚实的理论基础，为病原菌的防控提供有效策略与手段。

肠球菌是存在人、动物和环境中的一种常见机会菌，但现已发展成为医学和兽医临床上一种重要致病菌，迫切需要了解其适应性的机制（耐药、致病特征等）。本研究采用pK18mobsacB自杀载体或pLT06自杀载体，尝试使用接合或转化的方法构建肠球菌的遗传操作系统研究其致病性的调控，但由于肠球菌细胞壁厚、耐药性强等原因遇到了困难。试验遂进行了方案调整，基于肠球菌耐药性强的特征，通过基因组学测序、比较功能基因组学分析、功能基因鉴定、转座子分析、接合试验等方法在猪源肠球菌上鉴定了一个耐药基因新亚型lnu(G)、两个新型转座子（Tn6260、bcrABDR转座子）、一个新发现的约30Kb的 lsa(E)耐药岛和一个约160Kb的致病岛。UPLC-MS/MS证实Lnu(G)蛋白可通过腺苷化林可霉素而实现对林可霉素耐药，且lnu(G)基因位于一个长度为4.74kb的Tn6260转座子上。定位及测序分析显示，bcrABDR转座子与多药耐药基因簇erm(B)-aadE-spw-lsa(E)-lnu(B)和aadE-sat4-aphA3共同位于一个约65.5Kb的多药耐药质粒上，将显著有助于该质粒的维持和扩散。新发现的lsa(E)耐药岛含有erm(B)、aac(A)-aph(D)、aadE、 aphA3、 spw、lsa(E)和lnu(B)等7个耐药基因，位于染色体上。接合质粒的存在有助于耐药岛发生水平转移，从而使该耐药岛具有水平扩散的能力。获得该耐药岛可以使敏感菌至少具备对林可霉素、泰妙菌素、链霉素、大观霉素、庆大霉素和红霉素耐药。I-CeuI PFGE、S1-PFGE以及Southern杂交证实，肠球菌致病岛可以发生水平转移。通过共感染转录组学分析发现，共感染可促进粪肠球菌防御、粘附、致病、代谢等相关基因表达上调。体内感染试验进一步证实，共感染可导致其致病性增强。通过重组亚单位蛋白的表达、抗体制备、攻毒感染试验等方法，证实表达的EbpA1和EbpC1重组亚单位蛋白可诱导试验动物机体产生相对应的特异性抗体，且对动物有较强的免疫保护作用。项目鉴定的新型耐药基因、转座子可为肠球菌的遗传操作提供新的途径；发现的耐药岛、致病岛可为耐药性控制以及病原菌防控提供思路；制备的重组亚单位蛋白，可为粪肠球菌基因工程亚单位疫苗研制提供理论依据。