结核分枝杆菌磷酸葡糖胺变位酶 (GlmM) 的功能研究

结核分枝杆菌细胞壁的结构独特。分枝菌酸-聚阿拉伯半乳糖通过衔接二糖 (L-鼠李糖-N-乙酰葡糖胺) 与肽聚糖共价连接，因此，衔接二糖是维持结核分枝杆菌细胞壁完整性的重要组成结构。UDP-乙酰葡糖胺是衔接二糖中N-乙酰葡糖胺的糖基供体，又是肽聚糖的前体物。如果UDP-乙酰葡糖胺的生物合成受阻，必将影响细胞壁聚糖的合成及细胞壁结构的完整性，从而导致细菌的死亡。在UDP-乙酰葡糖胺形成过程中，结核分枝杆菌glmM (Rv3441c) 基因编码的磷酸葡糖胺变位酶 (GlmM) 催化葡糖胺-6-磷酸转变为葡糖胺-1-磷酸的反应，而人体细胞中不存在GlmM。本课题拟用基因敲除方法证明glmM是分枝杆菌生长的必需基因，以确定GlmM为抗结核新药的作用靶点；用反义RNA方法下调glmM基因表达，测定细胞壁中聚糖组分的变化，并用电镜观察细胞形态及其结构的变化；对纯化的GlmM进行酶促反应动力学特性的研究。

分枝杆菌具有特殊的细胞壁结构，其核心结构由分枝菌酸、聚阿拉伯半乳糖和肽聚糖三种大分子所构成。分枝菌酸-聚阿拉伯半乳糖通过L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺双糖衔接分子 (衔接二糖) 共价连接到肽聚糖大分子上。因此，双糖衔接分子是维持结核分枝杆菌细胞壁完整性的重要结构。双糖衔接分子中的D-N-乙酰葡糖胺由糖基供体UDP-N-乙酰葡糖胺提供，同时，UDP-N-乙酰葡糖胺也是肽聚糖糖链合成的前体分子。磷酸葡糖胺变位酶GlmM催化UDP-N-乙酰葡糖胺形成的第二步反应。目前，我们已完成了针对分枝杆菌GlmM酶的研究内容。(1) 鉴定了结核分枝杆菌Rv3441c和耻垢分枝杆菌MSMEG_1556是磷酸葡糖胺变位酶 (GlmM) 的编码基因glmM。(2) 构建了glmM基因敲除菌株LS2，LS2菌株在非允许温度条件下停止生长，且细胞形态发生明显的变化甚至发生裂解，确定glmM是分枝杆菌生长必需基因，GlmM是研发抗结核新药的作用靶点。(3) 构建了glmM反义RNA表达菌株，通过分析glmM反义RNA表达菌株中细胞壁糖组分、细胞形态和细胞结构的变化，说明GlmM蛋白表达量减少，使UDP-N-乙酰葡糖胺的生物合成降低，影响肽聚糖合成、聚阿拉伯半乳糖与肽聚糖的共价连接及细胞壁结构的完整性，最终导致细菌生长变缓及死亡。(4) 建立了快速、准确测定磷酸葡糖胺变位酶活性的DTNB化学显色法，并分析了结核分枝杆菌磷酸葡糖胺变位酶的酶促反应特性，测定了酶促反应动力学常数。将DTNB化学显色法优化成高通量筛选GlmM酶和GlmU乙酰基转移酶活性抑制剂的方法，为后续筛选GlmM和GlmU酶抑制剂奠定基础。