SMURF1介导的线粒体自噬在慢性肾脏病骨骼肌萎缩中的作用研究

Our previous study have found the actication of mitophagy in the skeltal muscle of patients with stage 5 chronic kidney disease,and abnormity of mitochondrial shape, function and DNA(mtDNA) in the skeletla muscle of rats with CKD. Recent reports demonstrated that inbition of mitophagy activate inflammasome and by mtDNA. It is known that mitophagy abnormity can cause cell injury, suggesting that mitophagy play a role in maintain muscle mass and mitophagy abnormity can cause muscle atrophy induced by CKD. In the present study, using the knockout mice of SMURF1 or overexpression plasmid of SMURF1, which is critical to mitophagy, we determined the impact of inhibition of mitohagy on skeletal muscle atophy,mitochondrial shape and function,mtDNA, and the activation of inflammsome. Futher, in vitro, we regulate the level of mtDNA to determine wether inhition of mitophagy cause inflamation through mtDNA.So as to lay the foundation for effective intervention or development of new drugs for skeletal muscle atrophy with CKD.

骨骼肌萎缩是蛋白质能量消耗的重要标志。我们发现，慢性肾脏病骨骼肌中线粒体形态、功能异常，线粒体DNA（mtDNA）含量减少且线粒体自噬活跃。SMURF1是新近报道的参与线粒体自噬的分子，线粒体自噬障碍可通过mtDNA促进炎症小体活化，加剧炎症反应。现已明确，线粒体自噬异常可导致细胞损伤。由此推测，线粒体自噬异常可加剧CKD骨骼肌萎缩。研究拟利用SMURF1基因敲除模型及SMURF1过表达质粒转染技术，在体内研究线粒体自噬异常对骨骼肌萎缩、线粒体形态功能的影响，并检测mtDNA-炎症小体途径的活化情况；原代培养正常小鼠及SMURF1基因敲除小鼠的骨骼肌细胞，采用质粒转染技术调控mtDNA水平，体外进一步明确线粒体自噬障碍是否通过mtDNA介导炎症反应。该研究将旨在阐明线粒体自噬在CKD骨骼肌萎缩中的作用机理，并为防治CKD骨骼肌萎缩提供新的理论依据。

慢性肾脏病（CKD）尤其是终末期肾病患者常合并骨骼肌萎缩，是影响CKD患者生存质量、增加住院率和死亡率的重要原因。低蛋白饮食是是维持CKD患者较好营养状态的重要方法。课题组前期研究发现CKD患者萎缩的腹直肌自噬过度活跃。因此本项目系统的研究：1）自噬在CKD 骨骼肌萎缩中的作用；2）低蛋白加酮酸饮食在 CKD 骨骼肌萎缩中的作用；3）CAPN6对自噬的调节作用及其在低蛋白加酮酸饮食维持骨骼肌肉含量中的作用。.本研究通过构建5/6肾切除大鼠模型，并给予自噬抑制药物wortmannin或3-MA腹腔注射，发现自噬抑制可改善CKD导致的骨骼肌萎缩；减少炎症小体NALP3/ASC/caspase-1及炎症因子IL-1β和IL-18。提示CKD自噬过度活跃是骨骼肌萎缩的重要原因，自噬抑制在改善线粒体自噬的同时可通过mtDNA-炎症小体途径减少炎症因子的释放，是自噬改善骨骼肌萎缩的重要机制。.本研究纳入上海4家医院确诊为糖尿病肾病（DN）、均属慢性肾脏病3-4期的61例患者，分为低蛋白饮食组(LPD，n=31)和低蛋白加α-酮酸饮食组(LPD+KA，n=30)，共随访12个月，发现LPD+KA组尿蛋白量下降较LPD组更明显。2组患者在随访期间营养状况均良好，与单纯低蛋白饮食相比，加用α-酮酸可显著增加患者血清白蛋白和前白蛋白浓度。提示LPD+KA较LPD在维持较好的营养状态下可更好地降低DN患者蛋白尿，但无显著改善肾功能的作用。进而通过5/6肾切除建立CKD大鼠模型，分别给予22%蛋白饮食（NPD）、6%蛋白饮食（LPD）、5%蛋白+1%酮酸饮食（LPD+KA），验证发现LPD+KA可以在LPD基础上进一步缓解CKD-NPD造成的骨骼肌萎缩，并发现，LPD+KA可以在LPD基础上进一步改善NPD导致的自噬标志性蛋白水平增加，减少总mtDNA的表达和mtDNA向胞浆的释放，减轻血清IL-1β和IL-18的升高。但是LPD+KA对CKD活化的炎症状态并无明显改善，对各种炎症因子作用不一。.动物实验发现CKD大鼠腓肠肌CAPN6表达增加。在大鼠L6成肌细胞，转染CAPN6干扰质粒，可以观察到自噬抑制。剥夺亮氨酸培养，发现其可以降低CAPN6表达，并活化自噬；补充亮氨酸后则相反。提示低蛋白加酮酸饮食可以通过增加CAPN6而抑制自噬，改善CKD骨骼肌萎缩。