M型线粒体在三角帆蚌性别分化过程中的动态变化及遗传基础

Hyriopsis cumingii is most important freshwater pearl mussel in China and the rule of inheritance of mitochondrial genome in H.cumingii is doubly uniparental inheritance (DUI), characterized by the presence of gender-associated mtDNA lineages that are inherited through males (male-transmitted or M types) or females (female-transmitted or F types), respectively. However, the formation mechanism of doubly uniparental inheritance is unkown. The objectives of the present study is to(1) Using fluorescent microscope to observe aggregation or degradation of sperm mitochondria in early embryo development including fertilized eggs, two cell stage,four cell stage, the eight,cell stageo f H. cumingii. (2)Using the technology of immunofluorescence to study the differential expression of F type and M type specific gene such as COII and ATP8 in the blastocyst, gastrula and glochidium stage.(3) Detect the expression difference of M type and F type specific sequences（COII and ATP8） in different juvenile and mussel stages including embryonic development 3,15,30 and 60 days juvenile mussels, and 3,9,15,18,30 and 36 months mussels. (4)Analysis aggregation way and aggregation period of M type mitochondria and degradation way and period of F type mitochondria of male gonad in H.cumingii. The determination of formation mechanism of DUI is studied from expression and localization of of F type and M type specific gene in each stage of the life history to the change of sperm mitochondria in early embryo development H.cumingii. This project is to provide new ideas for the study in sex determination and monosexual breeding research of freshwater pearl mussels.

三角帆蚌是我国最重要的淡水育珠母蚌，其线粒体基因组为特殊的双单亲遗传方式，存在F和M型2种mtDNA，M型mtDNA存在于成熟雄蚌的性腺中。本项目利用荧光显微镜观察受精卵、卵裂期M型线粒体的变化，包括线粒体数量的变化及在雄性胚胎和雌性胚胎中的聚集或消减情况。运用免疫荧光技术研究M型和F型特异基因COII和ATP8在囊胚期、原肠胚及钩介幼虫等不同发育阶段的表达差异，最后结合组织原位杂交和荧光定量PCR技术，研究3日龄到36月龄不同阶段三角帆蚌生殖细胞中M型和F型特异基因COII和ATP8的表达量和表达定位。从三角帆蚌生活史各个阶段M型和F型线粒体的动态变化及M型和F型特异基因的表达量和部位的动态变化，结合生殖细胞的组织学观察系统研究三角帆蚌双单亲遗传和性别分化之间的关系，研究结果为淡水蚌的性别决定、性别分化和雄性单性养殖研究提供新思路。

三角帆蚌是我国最重要的淡水育珠母蚌，目前在三角帆蚌未发现异型性染色体，其性别决定和性别分化的机制未知。其线粒体基因组为特殊的双单亲遗传方式，存在F和M型2种mtDNA，M型mtDNA存在于成熟雄蚌的性腺中。本项目从三个方面开展工作，一是从三角帆蚌生活史各个阶段研究M型和F型mtDNA的动态变化；二是通过三角帆蚌生活史各阶段生殖细胞发育的组织学观察，研究三角帆蚌性别分化的关键时期；三是从三角帆蚌性腺转录组学和microRNA组学中筛选了大量的性别相关基因和microRNA，做了基因功能的初步研究。研究结果显示三角帆蚌受精卵到钩介幼虫时期，同时存在F和M型线粒体。而从钩介幼虫到发育成熟的过程中，雌蚌中的M型降解，F型增多，而雄蚌中F型和M型均增多，但M型的增加更快。三角帆蚌在6月龄开始性别分化，M型线粒体的特异基因M型COⅡ在雌性三角帆蚌性腺分化阶段表达量急剧降解，而在雄性三角帆蚌M型COⅡ相对表达量有一个大幅的升高。而在6月龄幼蚌到24月龄成熟蚌中M型COII表达在雄性性腺中的表达在生长过程中逐渐升高，而F型COII的表达与之相反逐渐减低至消失，在24月龄成熟蚌雄性性腺中只检测到M型COII表达。另外M型和F型线粒体的另一个特异基因ATP8基因从在胚胎期到8月龄的三角帆蚌性腺部位组织团中各时期均有表达，同时期对比发现，F型ATP8基因的表达量明显高于M型ATP8基因。这些研究结果均表明M型线粒体的降解与保留直接和性别相关。研究结果为淡水蚌的性别决定、性别分化和雄性单性养殖研究提供新思路。项目资助发表论文16篇，其中SCI收录论文7篇，其余9篇为核心论文，申请发明专利2项，1项授权；培养硕士研究生10名和博士研究生1名，其中毕业硕士研究生8名；获中国产学研合作创新与促进奖产学合作创新成果一等奖。