泛素化通路调控果蝇精巢生殖干细胞命运的机制研究

泛素（Ubiquitin）依赖的蛋白质降解通路调控许多重要的生物学功能，如胚胎发育，细胞周期运转等。JAK/STAT与 TGF-?信号通路在调控果蝇发育过程和其他众多生命活动中承担重要作用。JAK/STAT通路通过活化果蝇精巢干细胞内靶基因的表达而维持干细胞的正常数量。TGF-?介导的靶基因转录沉默为该信号通路的重要特征，在果蝇精巢生殖干细胞系统中，TGF-?/Gbb作为重要外源信号，最终通过抑制bam基因的转录表达，从而维持干细胞的自我更新。近期研究发现，泛素信号通路也参与调控果蝇卵巢生殖干细胞的命运。我们初步的结果表明，泛素通路的一种成分E2（effete）是果蝇精巢干细胞维持的一个必需因子。本项目拟借助遗传学、生物化学和分子生物学等手段，揭示泛素通路调控精巢干细胞命运的分子机理，阐明该通路与已知的两条信号通路的作用关系。希望通过本工作能够为哺乳动物的干细胞命运决定机制的研究提供借鉴。

干细胞的维持和分化调控机理的研究一直是干细胞领域的热点之一。蛋白质降解相关的泛素化过程调控着众多的生物学过程。本课题选取泛素化通路的一种成分E2（effete）为研究对象，试图揭示出其调控果蝇精巢生殖干细胞命运的机理。从而为生殖疾病的治疗和再生医学研究等提供有价值的资料。.首先，我们构建了E-cad启动子驱动绿色荧光蛋白GFP表达的果蝇转基因载体。利用果蝇转基因技术，获得转基因品系果蝇。在此基础之上，采用免疫组织化学染色技术，对果蝇精巢干细胞微环境（Hub组织）进行标记，从而解决Hub组织难以标记、精巢生殖干细胞较难确认和统计的问题。此部分工作目前正在整理成文过程中。其次，采用酵母双杂交技术，以Effete为诱饵，我们构建了筛选载体GBKT7-effete，并转化酵母，实现对果蝇cDNA表达文库的生化学筛选。通过显色反应，在缺陷性酵母培养基上培养，我们获得了若干与Effete相互作用的候选因子。再者，初步检测并确证了Effete的功能。分析了羽化后约14天左右的野生型与effete突变体果蝇的精巢干细胞的数量。统计结果表明，与野生型果蝇相比，泛素化基因effete突变体的精巢干细胞的平均数量有降低的趋势。此工作需扩大样本数量对其进一步确证。此外，我们检测了部分雄性不育品系果蝇的精巢干细胞，得到了一些候选因子。此外，对果蝇精巢干细胞的研究现状进行了综述，本综述集中介绍了迄今发表的影响果蝇精巢干细胞维持与分化的因子、以及参与的信号通路。目前正在整理与撰写过程中。.部分后续工作包括，确证泛素化基因effete的功能。通过转基因技术，探求该基因的发挥功能的內源性或外源性特性。再者，通过更大规模的筛选检测，得到更多的影响精巢干细胞维持的调控基因。探求其与effete在功能上的相互作用关系，揭示基因effete的调控机理。.