糖原磷酸化酶过度活化胶质瘤细胞Na,K-ATP酶与替莫唑胺耐药相关性及机制研究

Glioma is characterized with high morbidity and high mortality, and temozolomide is still the standard chemotherapy in the treatment of glioma. O6-mG DNA methyltransferase repaired abnormal DNA injure is the main reason of temozolomide resistant in glioma. About 15-25% gap between chemosensitivity and clinical benefit rate suggested that tumor micro-environment regulated temozolomide resistance. We previously found that brain glycogen phosphorylase (GP-BB), as the key enzyme for activate glycogenolysis in tumor micro-environment, was associated with temozolomide resistance by potentially increasing activity of Na,K-ATPase. DAB, a glycogenolysis inhibitor, significantly reversed temozolomide resistance, however, its mechanism is not clear. Our project, based on previous work, adopt several molecular biological methods to clarify the effect of over-expression of GP-BB activated Na,K-ATPase in temozolomide resistance, and to further explore the mechanism of glycogenolysis activated of Na,K-ATPase and mediated EGFR and intracellular Ca2+ pathway to generate temozolomide resistance in cell dimension and animal model dimension. These results will not only offer drug-resistance biomarker in clinical individual treatment of glioma, but also provide new therapeutic strategies to reverse temozolomide resistance.

恶性胶质瘤具有发病率高和死亡率高的特点，替莫唑胺一直是治疗胶质瘤的标准化疗药。O6-mG DNA甲基转移酶（MGMT）异常介导DNA修复致替莫唑胺耐药，严重制约其在临床上的应用。替莫唑胺体外药敏有效率与临床获益率之间15-25%差异则提示肿瘤微环境可能调控替莫唑胺耐药。预实验发现作为激活肿瘤微环境中糖原分解的关键酶糖原磷酸化酶（GP-BB）在胶质瘤组织中高表达，其可能激活Na,K-ATP酶致替莫唑胺耐药，糖原分解抑制剂DAB显著逆转替莫唑胺耐药，但其机制尚不明确。本项目旨在前期工作基础上，利用多种分子生物学技术初步阐明高表达GP-BB激活Na,K-ATP酶介导替莫唑胺耐药作用，在细胞和动物模型维度进一步探讨GP-BB介导EGFR/细胞内Ca2+信号通路上调MGMT蛋白表达，致替莫唑胺耐药。此项研究将为临床个体化治疗胶质瘤提供有临床价值的耐药生物标志物，并为逆转替莫唑胺耐药提供新的治疗策略。

胶质瘤是中枢神经系统最常见和侵袭性较强的恶性肿瘤肿瘤，尤其是高级别侵袭性胶质瘤(III级和IV级)的治疗选择有限且生存预后较差。IV级胶质瘤患者即使接受了最大限度的切除、放疗和序贯替莫唑胺(TMZ)治疗，但中位生存期仅为12 - 18个月。TMZ是一种口服细胞毒性DNA烷基化化疗药物，属于高级别胶质瘤患者的标准用药，但研究显示TMZ临床应用有很多局限性，如O(6)-甲基鸟嘌呤- dna甲基转移酶(MGMT)高表达和MGMT甲基化降低的胶质瘤患者对TMZ的反应较差。目前基于基因遗传学和肿瘤微环境结果显示，TMZ的应用不足以为高级别胶质瘤提供有效治疗保障。因此，探究替莫唑胺(TMZ)诱导胶质瘤耐药的机制基础是该肿瘤有效化疗的重要障碍。糖原分解介导糖原磷酸化酶同工酶BB (GPBB)在细胞增殖和钾稳态中发挥重要作用。本研究首先在临床样本结果揭示，血浆GPBB与TMZ耐药相关，在存活率较低的TMZ耐药患者队列中，血浆GPBB浓度高于TMZ敏感患者(31.78 ng/ml vs.21.42 ng/ml, P < 0.001)。采用ROC曲线分析高级别胶质瘤患者血浆GPBB浓度，以30.71为最佳截断值，可获得66%的灵敏度和88%的特异性评价预测TMZ的敏感性 (AUC:0.835, 95% CI 0.737 - 0.933)，以预测体外对TMZ的反应。细胞株基础研究显示：cAMP和TMZ通过上调MGMT表达，抑制细胞增殖和诱导TMZ耐药。通过糖原分解抑制剂和特异性GPBB抑制剂DAB处理证实该过程依赖糖原分解。急慢性TMZ处理胶质瘤细胞株，可导致[Ca2+]i、细胞外调节激酶(ERK)1/2磷酸化上调，以及Na、K-ATPase、ERK1/2和MGMT蛋白上调。通过应用瞬时受体电位通道1和肌醇三磷酸盐受体抑制剂，其TMZ和cAMP的上调作用均被抑制，而L型-通道[Ca2+]i抑制剂和RyR拮抗剂无抑制作用。这些结果表明[Ca2+]依赖型糖原分解参与获得性胶质瘤TMZ耐药的机制可能是通过Na,K-ATPase/ERK1/2信号通路上调MGMT表达，本研究构建出糖原分解和GPBB可能参与TMZ耐药的分子机制图。研究结果提示GPBB和糖原分解可能是治疗TMZ耐药胶质瘤的新靶点，为临床上克服TMZ耐药和改善胶质瘤患者的预后提供新的治疗策略。