3-甲硫基丙醇的Saccharomyces cerevisiae关键代谢分子调控机制研究

3-甲硫基丙醇及其衍生物是多种发酵食品的主体风味，是一类安全、允许使用的食用香料。目前硫醇类香料主要通过化学合成，不符合环境友好生产要求。. 分析认为"转氨反应、脱羧反应、去甲硫基反应是3-甲硫基丙醇生物合成的关键限速步骤"，并以此为指导，以Saccharomyces cerevisiae SC57为模式菌，设计以上反应的关键限速酶基因（AR08、AR09、AR10）单独过量表达、耦合过量表达、MGL基因敲出的研究方案，研究其对于代谢途径的优化效应和分子调控机制，解析其代谢通量分配及关键节点；构建代谢工程菌，探索耦合关键步骤中正向、反向分子调控作用，增强主途径的关键酶基因表达，减弱或消除副反应途径的酶基因表达，优化代谢网络的效果，明确关键限速酶及调控模式。酵母菌转化制备的天然甲硫醇类香料，构型、手性单一，香气品质高，为天然香料制备提供了新思路和理论支持，研究成果有望获得自主知识产权。

3-甲硫基丙醇（MTP）是我国芝麻香型白酒的典型特征性风味物质，也是多种发酵食品的重要风味组分，广泛应用于多种果蔬及酒用香精的调配。资料初步显示MTP生物合成与L-蛋氨酸(L-Met)分解代谢及Ehrlich途径有关，不同微生物的MTP合成代谢途径、关键酶、调控机制等不尽相同。本项目以Saccharomyces cerevisiae为模式菌，研究MTP关键代谢分子调控机制，构建优良工程菌株，优化其代谢途径和网络，解析其关键酶、关键节点。项目按计划实施，基本达到预定目标，完成任务指标。主要结果如下：（1）S. cerevisiae不存在去甲硫基酶（EC4.4.1.11）及其基因（MGL），存在较高活性的胱硫醚-裂解酶（Cys3）及其基因CYS3，并参与L-Met分解代谢，构建的CYS3基因敲除工程菌，其MTP生成量较野生型菌S. cerevisiae S288C降低55.2%（p＜0.01），对MTP合成呈现明显负调节效应，并未表现“减弱或消除该副反应途径，可增强MTP代谢流量”的预期。（2）S. cerevisiae 中存在至少2种氨基转移酶基因（ARO8和ARO9），构建的ARO8基因过表达工程菌S. cerevisiae AR8，其氨基转移酶活力较S288C提高1.63倍，而ARO9基因过表达的工程菌AR9，该酶几乎无变化，表明ARO8基因在S. cerevisiae的MTP合成代谢中发挥重要调控作用。（3）构建了脱羧酶ARO10基因过表达的工程菌S. cerevisiae AR10、ARO10基因和ARO8基因耦合过表达工程菌S. cerevisiae AR8-10，AR10的脱羧酶活力较S288C提高2.16倍，MTP产量提高34%，AR8-10的脱羧酶和氨基转移酶活力分别较S288C提高1.28倍、1.10倍，MTP产量提高51%，表明ARO8和ARO10基因在S. cerevisiae的MTP合成代谢中发挥正调节效应，且耦合过表达较分别单独过表达对MTP合成代谢流量有更好的协同优化效果；工程菌S. cerevisiae AR8-10在5L发酵罐中MTP产量达到3.5g/L，达到国外报道优良菌株的发酵水平，展示了较好应用前景。项目成果首次从基因转录、酶表达及代谢物等层次水平，研究揭示3-甲硫基丙醇关键代谢分子调控机制，具有重要理论意义和学术价值。