PTEN和ChABC双基因干预的脂肪间充质干细胞移植治疗大鼠急性脊髓损伤的疗效及机制研究

Existing treatments of acute spinal cord injury are often unsatisfactory. On the basis of previous research, we propose to use PTEN and ChABC double genes intervention on Adipose-Derived Stem Cells transplant to cure acute spinal cord injury. PTEN is Tumor Suppressor Gene. If PTEN gene silencing by RNAi, the survival ability, expansion and differentiation of transplanted cells could be enhanced in the hypoxic microenvironment, which could eliminate the internal factors of nerve regeneration. Chondroitinase ABC could degrade chondroitin sulfate proteoglycans（CSPGs）which is the main component of glial scar. By lentivirus-mediated overexpressed ChABC genes, obstruction of glial scar could be relieved, which could eliminate the external factors of nerve reconstruction. Meanwhile, as the unstable of siRNA, the silence of PTEN is temporary, which could avoid tumor formation. While the lentivirus-mediated overexpressed ChABC could be long-term and stable expression and not avoid glial cells release neurotrophins. In this study, blocking the inhibition of endogenous and exogenous factors could play synergy, promote more effective neurological rehabilitation after SCI. Combined gene therapy and cell therapy could also show more advantages.

急性脊髓损伤（SCI）现有的治疗方法多不理想。申请者在以往研究基础上，提出用PTEN及ChABC双基因干预的脂肪间充质干细胞移植治疗SCI。PTEN 是抑癌基因，通过RNAi沉默PTEN 基因，可增强移植细胞在缺血缺氧微环境中的存活、扩增和分化能力，消除神经再生的内部抑制因素；硫酸软骨素酶ABC（ChABC）可降解胶质瘢痕的主要成分硫酸软骨素蛋白多糖（CSPGs），通过慢病毒介导使ChABC基因过表达，可减轻胶质瘢痕的阻碍，畅通神经通路，消除了影响神经功能的外部因素。同时，由于siRNA转染不稳定，PTEN基因沉默具有暂时性，避免了肿瘤形成；而慢病毒可使ChABC基因获得长期稳定表达，有利于发挥长期的瘢痕抑制作用，且不影响胶质细胞释放神经营养因子。本研究阻断内源及外源抑制因素，发挥协同作用，同时联合基因治疗和细胞治疗，更有效地促进SCI后的神经康复。

急性脊髓损伤（SCI）是一类严重威胁人类健康和生存质量的常见创伤，脊髓损伤后致瘫性高，但损伤后神经系统的再生和修复仍是技术难题。脂肪间充质干细胞（Adipose-Derived Stem Cells，ADSCs）具有获取容易，增殖能力强，传代稳定，及可诱导向神经分化等优势，是理想的移植治疗种子细胞。然而，由于缺血缺氧的局部微环境使移植细胞缺乏足够的扩增、再生及分化能力，以及损伤后胶质瘢痕增生及其分泌的抑制因子阻碍轴突生长，无法形成有效的突触连接，使得细胞移植治疗效果并不理想。本研究中，我们通过构建ChABC表达以及PTEN基因沉默的基因修饰ADSCs，使得移植到损伤部位的细胞既有较强的增值分化能力，又能产生ChABC而减少损伤后胶质瘢痕的形成。通过向ADSCs转染携带外源基因ChABC的慢病毒，我们成功构建了能稳定表达ChABC的细胞系，并且通过transwell实验验证了体外穿透基质胶的能力确实增强。在此基础上，通过RNAi技术向细胞内再次转染能够瞬时沉默抑癌基因PTEN的SiRNA，使本细胞系在短期内获得了类似肿瘤细胞的增殖能力，增强了细胞在损伤局部微环境中的生存能力以及成神经分化能力，由于SiRNA沉默时间短，减少了成瘤风险。因需要进一步探索ADSCs成神经分化方法，我们使用了穿心莲内酯作为成神经分化的促进药物，并探讨了其分子机制。在体外实验的基础上，我们通过构建大鼠脊髓损伤动物模型来探讨双基因修饰的ADSCs的移植治疗效果，通过向脊髓损伤大鼠损伤部位的局部细胞移植，我们发现双基因修饰后的细胞移植组能显著减少损伤后局部瘢痕形成，而且各组移植细胞均能较好的分化为神经元。通过对移植治疗后行为学评估我们发现，双基因修饰移植组的功能恢复显著高于其他组，从而验证了双基因干预ADSCs细胞移植的实际疗效，为后期应用于人类脊髓损伤患者提供有力的证据支持。