玉米自交系体细胞再生决定基因的精细定位

The genotype dependence of somatic regeneration in maize inbred is essentially the core gene that determines the regeneration of somatic cells. However, these genes have rarely been reported, and have become the bottleneck restricting the application of maize biotechnology. In our previous work, we completed the genome deep sequencing of 210 northern spring maize core inbreds by whole genome resequencing technology. The primary mapping of 54 genes by GWAS may be related to the somatic regeneration. On this basis, the project continues to identify the target traits for the association population, and use multiple models of different GWAS strategies to finely locate candidate genes for somatic regeneration in maize inbred. At the same time, using the simplified genome sequencing technology to sequence the constructed F2 generation population, locate the QTLs controlling the target traits, and combine the results of the natural population to select stable and major candidate genes. The CRISPR/Cas9 and overexpression technologies were used to verify the function of the stable and major candidate genes, and finally determine the determinant genes that control the regeneration of somatic cells in maize inbred. The completion of this project not only has important significance for the analysis of the molecular genetic mechanism, but also provides inbreds for the improved breeding of maize biotechnology.

玉米自交系体细胞再生的基因型依赖性实质上是其内源存在决定体细胞再生的核心基因，而目前这类基因却鲜有报道，已经成为制约玉米生物技术改良应用的瓶颈因素。在前期工作中我们利用全基因组重测序技术完成了对210份北方春玉米核心自交系的基因组深度测序，通过GWAS分析初步定位到54个基因可能与自交系的体细胞再生密切相关。本项目在此基础上，拟继续对关联群体进行目标性状鉴定，运用不同GWAS策略的多种模型精细定位控制玉米自交系体细胞再生的候选基因；同时，利用简化基因组测序技术对已构建的F2代群体进行测序，定位控制目标性状的QTL，结合自然群体的关联结果，筛选稳定、主效候选基因；采用CRISPR/Cas9和过表达技术分别对稳定、主效候选基因进行功能验证并最终确定控制玉米自交系体细胞再生的决定基因。本项目的完成不仅对解析体细胞再生的分子遗传机理具有重要意义，同时也为玉米生物技术改良育种提供了基础自交系材料。

玉米生物育种依赖于自交系的体细胞再生，但由于人们对植物细胞全能性诱导机理的认识有限，缺乏体细胞高频再生的优良自交系，已经成为基因编辑等在玉米遗传改良中应用的瓶颈。本研究利用自然群体和分离群体两种材料，采用GWAS和QTL定位两种方法深入挖掘控制体细胞再生的数量性状位点，筛选稳定、主效候选基因。随后分别采用表达模式分析、单标记连锁分析、候选基因过表达和基因编辑等递进深入地验证基因功能，旨在最终确定控制体细胞再生的决定基因。实验结果显示两种群体的体细胞再生性状遗传变异均较大，广义遗传力在0.71-0.78之间，说明它们主要受遗传因素控制；利用FarmCPU方法对关联群体进行GWAS，结果共定位237个标记与胚愈率等性状显著关联（P < 0.000001），挖掘候选基因129个；采用复合区间作图法对分离群体进行QTL分析，共定位12个胚愈率和绿苗再分化率的QTL，它们分布在5条染色体上的5个区段；联合连锁和关联分析的定位结果，发现共有20个显著性SNP位于定位的4个QTL，挖掘一致性稳定、主效候选基因14个；利用qPCR技术对上述基因的表达量进行鉴定，结果表明ZmCLE4B和ZmPRX19等13个基因在极端表型自交系愈伤诱导时期均具有不同的表达模式，说明它们对诱导剂2,4 - D的培养响应存在差异；进一步利用F2群体对ZmCLE4B等基因进行单标记连锁分析发现，具有不同纯合等位基因ZmCLE4B的植株表型差异显著（P < 0.05）；最后，在玉米和拟南芥中对主效基因进行过表达和基因编辑，结果表明过表达ZmCLE4BAA能够加快拟南芥叶片脱分化并促进愈伤组织生成。同时基因编辑ZmPRX19抑制了玉米体细胞的再生效率。综上，我们得出ZmPRX19和ZmCLE4B可能是玉米自交系体细胞再生的决定因子。本研究结果为高频体细胞再生自交系的分子育种奠定了理论和材料基础。