青兰属黄酮类化合物基于Nrf2-ARE信号通路对脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制

The redox sensitive transcription factor nuclear factor erythroid-2 related factor 2(Nrf2) plays a key role in the cellular defence against oxidative stress. It binds to the antioxidant response element(ARE) and regulates the expression of multiple cytoprotective proteins, including antioxidant proteins and phase Ⅱdefence enzymes. There is increasing evidence showing that induction of Nrf2-ARE pathway can confer protection against cerebral ischemia-reperfusion injury. Our preliminary data showed that many flavonoids isolated from Dracocephalum herbs are robust Nrf2 activators and have potential therapeutic effects against cerebral ischemia through activation of the ARE. The objective of the proposal is to investigate whether the flavonoid compounds identified as potent Nrf2 activators can ameliorate cerebral ischemia-reperfusion injury in cellular and animal models of cerebral ischemia and how Nrf2/ARE pathway and the apoptotic ASK1-p38 MAPK/JNK pathway are involved. We will use primary cultured neurons and astrocytes to examine the protective potential of the Nrf2 activators, and test whether the isolated Nrf2 activators can attenuate cerebral ischemia-reperfusion injury in MCAO models of Nrf2-/- and wild-type mice. Finally, we will determine the molecular targets of these compounds. This information will be valuable for future development of new therapeutic strategies for the treatment of stroke

Nrf2-ARE通路是细胞抵抗氧化应激损伤的最主要内源性通路之一。近年的研究显示，诱导该通路的激活对脑缺血再灌注损伤可发挥明显保护作用。前期研究发现青兰属药用植物中含有的多种黄酮类化合物为Nrf2诱导剂，细胞和动物实验表明该类化合物对脑缺血再灌注损伤有较好保护作用，且此保护作用与Nrf2-ARE通路诱导密切相关。因此本课题拟系统分离筛选青兰属药用植物中黄酮类Nrf2诱导成分，并通过MCAO小鼠脑缺血再灌注损伤模型和OGD致小鼠脑皮层神经元及星型胶质细胞损伤模型评价该类化合物对脑缺血再灌注损伤的保护作用；从抗氧化及抗凋亡角度阐明该类化合物调控Nrf2-ARE通路及下游凋亡相关ASK1-p38 MAPK/JNK通路对脑缺血再灌注损伤的保护作用机制；并以活性最强化合物为小分子探针寻找作用靶点。以期为脑卒中的治疗提供一种新策略，为筛选Nrf2-ARE通路诱导剂治疗缺血性脑血管疾病提供新思路和途径。

缺血性脑卒中严重危害人类健康，是目前继心血管病之后的第二大死因。目前临床上尚无治疗中风的有效策略。脑缺血再灌注损伤与多种机制密切相关；其中，由活性氧引起的氧化应激在脑缺血再灌注损伤中占据重要地位。Nrf2-ARE 信号通路作为细胞抵抗氧化应激损伤的最主要内源性通路之一，其在脑缺血再灌注损伤中的所发挥的作用也逐渐成为近年来研究的热点之一。激活Nrf2-ARE 通路有可能成为缺血性脑卒中治疗的新策略。本项目主要完成了青蓝属药用植物中黄酮类Nrf2诱导成分的系统分离及活性评价，并对其中Nrf2诱导活性较强的化合物进行了系统的细胞和动物实验，观察了其对H2O2及糖氧剥夺(OGD)所致离体培养神经细胞氧化应激损伤的保护作用及对MCAO动物脑缺血再灌注损伤的保护作用，并对其作用机制进行了深入的探讨。细胞实验中采用OGD损伤原代培养小鼠脑皮层神经元、星形胶质细胞制备体外脑缺血再灌注损伤模型，对Nrf2诱导成分的神经保护作用进行评价。首先利用CCK-8、LDH漏出率实验等检测了化合物对对OGD 损伤原代培养神经元及星形胶质细胞氧化应激损伤的保护作用；在此基础上筛选出活性较好的化合物及合适的剂量范围；进而通过 TUNEL染色、Hoechst33258染色、Western blot 等试验观察化合物对神经元及星形胶质细胞凋亡的保护作用；流式细胞仪测定ROS水平，比色法测定GSSG/GSH水平确定化合物的抗氧化作用效果。采用经典的大脑中动脉内栓线阻断法制备小鼠局灶性脑缺血再灌注（I/R）损伤模型，激光多普勒血流测定仪监测脑血流量变化，采用TTC染色测定脑梗死面积、神经病学评分等方法初步确定化合物对脑缺血再灌注损伤的保护作用；进而通过TUNEL染色检测缺血侧脑组织神经元凋亡情况，Western blot检测Cleaved caspase-3、p-JNK、p-p38等蛋白表达确定化合物对MCAO小鼠脑组织凋亡的保护作用。机制研究发现化合物保护作用与激活Nrf2通路及抑制下游JNK/p38凋亡信号通路有关。课题研究结果系统阐明了该类化合物对脑缺血再灌注氧化应激损伤的保护作用及其作用机制，为筛选Nrf2/ARE通路诱导剂作为神经保护剂治疗脑卒中提供了理论基础和开辟了新思路。