敲除CCR5基因的造血干细胞治疗恒河猴艾滋病的实验研究

In 2009, a German research group reported that an AIDS patient was cured by heterologous transplantation of human hematopoietic stem cells (HSC) with naturally occurring CCR5 deletions (△32CCR5). However, △32CCR5 donors are scarce in the world, therefore, this method is unable to be applied extensively. Transplantation of artificially CCR5-disrupted HSC is more feasible and has been regarded as a potential way to be applied in clinic. However, there is a need to confirm its efficay and safety in a non-human primate (monkey) model before conducting any clinical trials in the use of transplantation of artificially CCR5-disrupted HSC for curing AIDS. Our present study is to explore the feasibility of curing SIV infection in rehsus monkeys by autologous transplantation of the artificially CCR5-disrupted HSC with ZFN technology. This work follows our previous experiment that the human induced pluripotent stem cells artificially disrupted CCR5 gene using the same technology could be differentiated in vitro into HSC that formed all types of hematopoietic colonies.. Our work may speed the process from bench to clinic of applying the stem cell transplantation for curing human AIDS.

2009年，德国报道首例艾滋病患者通过异体移植天然缺失32碱基的CCR5基因（△32CCR5）型造血干细胞（HSC）而获得根治。但是，全球拥有天然△32CCR5基因型造血干细胞的人很少，因此这种方法无法推广应用。治疗艾滋病更理想的方法是移植人工敲除CCR5基因的自体HSC。目前，这种方法被认为具有极大的临床应用潜力。但是，在开展自体CCR5基因缺失型HSC回输治疗艾滋病的临床试验之前，需要在大动物（恒河猴）模型中验证其有效性和安全性。本项目在我们前期敲除人诱导多能干细胞CCR5基因并将其分化成造血干细胞的技术基础上，进一步用恒河猴艾滋病模型开展实验研究：拟将已经建立的锌指核酸酶（ZFN）技术敲除SIV（猴免疫缺陷病毒）感染猴造血干细胞的CCR5基因，然后回输给感染猴体内，观察这种治疗方法的有效性和安全性，为下一步的临床试验奠定实验基础。

敲除自体造血干细胞中CCR5基因后移植回输治疗艾滋病患者的基因治疗法被认为最有可能取得成功的艾滋病根治方法，但需要在动物模型中验证其有效性和安全性。本项目为了证明艾滋病基因治疗方法的有效性和安全性，以恒河猴为模型，通过不同的基因敲除技术（ZFN，TALEN,CRISPR/Cas9），对恒河猴的T细胞和造血干细胞进行基因敲除，并移植回输到艾滋病猴体内，进行艾滋病的治疗。本项目的研究过程中，开发了一项渗透性TALEN基因敲除技术，此技术不需要转基因，即可对细胞内的目标基因进行高效敲除。而利用CRISPR/Cas9基因敲除技术,通过慢病毒转染，可以更高效敲除细胞中的基因，CCR5基因敲除效率达到80%以上。为了有效的分离猴造血干细胞，分别采用的骨髓穿刺以及血细胞分离机进行造血干细胞的分离。在无实验动物专用的血细胞分离机的情况下，摸索出人的血细胞分离机用于实验猴进行血细胞分离的方法。建立了猴T细胞和造血干细胞基因敲除后安全移植回输及其免疫指标、病毒载量监测的方法。本项目的研究为临床应用基因敲除技术治疗艾滋病提供了一定的实验依据。