一种原核异头糖激酶的催化机理研究及其在非天然糖核苷酸合成中的应用

Unnatural sugar nucleotides are valuable tools for developing potential drug targets with novel effects, and investigating catalytic mechanisms of carbohydrate synthesizing enzymes. Enzymatic synthesis of UDP-GlcNAc, the sugar nucleotide form of GlcNAc, has limitations in laborious steps and low yields since the GlcNAc kinases phosphorylate the sugar at its 6-position. This has also restricted enzymatic synthesis of sugar nucleotides for unnatural GlcNAc derivatives. Researchers found an N-acetylhexosamine 1-kinase in Bifidobacterium longum, which could efficiently synthesize GlcNAc-1-phosphate (GlcNAc-1-P) and reduce the labor for UDP-GlcNAc synthesis. The enzyme could also convert many unnatural GlcNAc derivatives into the corresponding sugar-1-Ps for further synthesis of unnatural sugar nucleotides, making the enzyme an excellent tool for enzymatic synthesis of UDP-GlcNAc and its unnatural derivatives. The goal of this proposed research is to investigate the catalytic mechanism of the sugar kinase with novel function. Site-directed mutagenesis and truncated mutagenesis, based on amino acid sequence analysis and secondary structure, will be employed to study the structure-function relationship of the enzyme and infer its catalytic mechanism. Mutants with improved enzymatic properties (broader substrate specificity or higher efficiency) will also be designed by molecular modification to facilitate synthesis of natural and unnatural sugar nucleotides.

非天然糖核苷酸是开发具有新的药物活性的化合物和研究糖类合成酶机理的重要工具。因其激酶催化6-位磷酸化反应，N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）的糖核苷酸（UDP-GlcNAc）的酶法合成步骤繁琐且收率低，其非天然糖衍生物的糖核苷酸的酶法合成更难实现。研究发现，长双歧杆菌的一种N-乙酰氨基己糖1-位激酶能高效合成GlcNAc-1-磷酸糖、简化UDP-GlcNAc的合成，而且能将GlcNAc的多种非天然衍生物高效转化为1-磷酸糖并进而合成非天然糖核苷酸，是酶法合成UDP-GlcNAc及其非天然衍生物的很好的工具酶。本申请拟通过点突变研究该糖激酶的活性位点和结构功能关系；根据蛋白的二级结构设计截短突变，研究其行使催化功能所需的核心区域；进而推测其催化机理。我们将根据此酶的结构功能关系及对其反应机理的推测设计突变，探索改造出能识别更多非天然糖底物或转化效率更高的酶，用于天然及非天然糖核苷酸的合成。

长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）的N-乙酰氨基己糖1-位激酶（BlNahK）可将N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）/N-乙酰氨基半乳糖（GalNAc）等化合物进行1-位磷酸化修饰，这种活性不同于以往报道的GlcNAc激酶（将GlcNAc的6-位磷酸化），而且它可识别并磷酸化多种结构与天然底物相似的化合物，因此，研究该酶的活性位点特别是其底物结合位点，有助于了解该酶的底物偏好性，指导我们定向对该酶进行改造，获得更实用的工具酶。.本项目通过构建突变体酶并测定酶学性质，同时尝试对该酶进行蛋白结晶工作，研究该酶的活性位点并推测其催化机理，并在此基础上对该酶进行分子改造，更好地用于天然及非天然糖核苷酸的制备。在项目进行到中后期时，台湾和日本两个研究组分别报道了该酶的晶体结构并推测了其催化机理，因此，根据他们的研究结果，此项目调整了研究方向，根据酶的晶体结构和目标的非天然糖底物进行理性设计，对该酶进行改造，使其能够用于其他磷酸糖的合成。.（1）对比糖激酶的活性检测方法，确定利用指示剂检测还原糖的DNS法用于酶活性分析，使用与NADH的消耗反应偶联的检测法进行酶动力学分析。.（2）BlNahK的定点突变及活性分析。根据NCBI数据库中对BlNahK序列的注释中标出的底物结合位点进行定点突变研究，获得了多个突变体酶。酶学活性分析结果显示，D208位的突变严重影响了酶的催化活性，该氨基酸是BlNahK发挥催化功能的关键位点；H31、I24和F247对酶的活性有一定程度的影响。其中突变体F247Y对天然底物GlcNAc和GalNAc的催化效率高于野生型酶，且其在反应温度（37oC）下稳定性较好，与作为工具酶的需求相吻合。.（3）BlNahK的截短突变及活性分析。根据程序预测的二级结构，将N端和C端第一个具有二级结构的肽段分别截去，研究该肽段在蛋白折叠/酶催化过程中所起的作用。构建的截短突变体蛋白无法可溶表达并被纯化出来。所截去的肽段在酶的三维结构中起重要作用。.（4）BlNahK的理性设计改造。根据文献报道的BlNahK晶体结构，使用软件对目标非天然糖底物在BlNahK中进行分子对接分析，并参考BlNahK中与天然糖底物结合和催化时起重要作用的氨基酸，设计点突变体，并对酶进行定点突变，检测突变体酶对目标非天然糖底物的活性。此工作为调整后增加的内容，尚在进行。