α-烯醇化酶对籽鹅卵泡颗粒细胞分泌功能、增殖与凋亡的影响及机制

Follicular development directly affects poultry laying performance.The morphology, number and function of the granulosa cells have an important effect on follicular development therefor the study about the mechanism of regulation of granulosa cell has important theoretical and practical significance. That α-Enolase(ENO1) expression was high in follicular in rapid growth period of Zi goose was found in the previous study, which suggested that ENO1 plays an essential role in proliferation and apoptosis of the granulosa cells to regulate follicular development. ENO1 is a multifunctional protein, which is the key enzyme involved in the process of glycolysis, transcription, cell apoptosis and regulation etc.The current project will firstly construct over/interference adenovirus vectors with ENO1 gene and infect into follicular granulose cells of Zi goose in vitro. The effects of different levels of ENO1 expression on the proliferation, apoptosis, glycolysis and hormones secretion of the granulosa cells will be detected using flow cytometry, realtime-PCR, immunohistochemistry, and other molecular biology techniques, with histological localization and orderliness of ENO1 in different growth phases of Zi goose ovarian tissue and different levels of follicle of laying period Zi goose in order to explore the effects and mechanism of α-enolase on secretion function，proliferation and apoptosis of Zi goose's granulosa cells to regulate the follicular development.

卵泡发育直接影响禽类产蛋性能，而颗粒细胞的形态、数量与功能对卵泡发育具有重要影响，因此，研究禽类颗粒细胞具有重要的理论与实际意义。申请者在前期研究中发现，α-烯醇化酶（α-Enolase，ENO1）在快速生长的籽鹅卵泡中表达水平较高，推测其可能通过影响颗粒细胞的分泌功能、增殖与凋亡进而调控卵泡发育。ENO1是一种多功能蛋白，可作为糖酵解酶，也可参与转录、细胞凋亡及调控等过程，因此本项目拟通过构建过表达和干扰表达ENO1的重组腺病毒，感染体外原代培养的籽鹅卵泡颗粒细胞，通过流式细胞术、实时荧光定量PCR、Western blotting、免疫组化等方法研究不同表达水平的ENO1对籽鹅卵泡颗粒细胞糖酵解、增殖、凋亡与激素分泌功能的影响及机理，结合ENO1在不同发育阶段籽鹅卵巢组织及产蛋期籽鹅各级卵泡的组织学定位及表达规律，探讨ENO1通过影响颗粒细胞分泌功能、增殖与凋亡调控卵泡发育的作用机制。

籽鹅是世界上产蛋性能较高的鹅品种之一，研究籽鹅卵泡发育的调控机制具有重要意义。本试验依据禽类卵泡发育特点，研究α-烯醇化酶（α-enolase，ENO1）在产蛋期籽鹅卵巢各级卵泡的组织学定位及表达规律，同时构建ENO1基因过表达和干扰表达重组质粒，转染原代培养的籽鹅卵泡颗粒细胞，研究ENO1对颗粒细胞糖酵解、激素分泌功能、生殖相关激素受体表达及增殖、凋亡的影响，为明确ENO1在禽类生殖生理中的作用提供依据。（1）研究籽鹅不同等级卵泡颗粒细胞组织学结构及ENO1的表达规律，同时获得不同等级卵泡ENO1基因、6种生殖相关激素受体基因及2种凋亡相关基因表达量的基础数据。（2）成功构建ENO1基因过表达和干扰表达重组质粒，实现了在卵泡颗粒细胞中的过表达和干扰表达。（3）ENO1基因干扰使颗粒细胞摄取葡萄糖能力下降，细胞上清液丙酮酸、乳酸浓度下降，ATP含量和PK基因表达量下降，提示ENO1基因干扰表达可减缓糖酵解进程；促进颗粒细胞雌激素、活化素、孕酮和睾酮的分泌，降低卵泡抑素和抑制素分泌，同时下调FSHR、LHR、ERα、ERβ、GHR和IGFBP-1 基因表达量；使颗粒细胞增殖变慢，凋亡增加，G2/M期颗粒细胞比例增高，提示ENO1基因干扰表达可使颗粒细胞发生G2/M期阻滞，诱导细胞发生凋亡，抑制细胞增殖。（4）ENO1基因过表达使颗粒细胞上清液葡萄糖浓度下降，丙酮酸、乳酸浓度升高，细胞ATP含量和PK基因表达量升高，提示ENO1基因过表达可加速糖酵解进程，使颗粒细胞糖酵解供能所占比例增加；促进颗粒细胞孕酮、活化素、抑制素的分泌，抑制卵泡抑素和睾酮的分泌，同时促进FSHR、ERα、ERβ、GHR和IGFBP-1基因表达，抑制LHR基因表达；促进颗粒细胞增殖、减少凋亡并使G0/G1期颗粒细胞比例下降，S期和G2/M期颗粒细胞比例增高，提示ENO1基因过表达可诱导颗粒细胞DNA合成增加，使处于增殖期的颗粒细胞数量增加，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。上述结果说明，ENO1可通过调控卵泡颗粒细胞的糖酵解、分泌功能、生殖激素受体表达、凋亡和细胞周期的时相性影响籽鹅卵泡的生长发育和排卵。