拟南芥TCP转录因子对水杨酸信号途径的负调控作用机理研究

An upstream fragment involved in the negative regulation of the expression of ICS1, a key enzyme in the biochemical pathway of salicylic acid biosynthesis in Arabidopsis, was identified by dissecting its promoter region, and subsequently, a TCP transcription factor, AtTCP8, was isolated by yeast one-hybrid screening and its binding to the promoter of ICS1 confirmed. Although tcp8-1 did not show any obvious phenotype involved in SA signaling, over-expression of AtTCP8 significantly repressed ICS1 expression under various stresses, demonstrating that AtTCP8 was a direct negative regulator of ICS1 expression in SA signaling. Besides, either over-expression of AtTCP8 or repression of its downstream gene expression produced significant/dramatic impacts on plant growth and development. This project is designed to pursue further explorations in following aspects: 1) to thoroughly explore the regulation of ICS1 expression by AtTCP8, and to identify redundant TCP protein(s) with similar function; 2) to explore the coordinated regulatory mechanism of different negative regulators involved in the regulation of ICS1; 3) to reveal the mechanisms of plant growth and development associated with ICS1 and/or SA signaling regulated by AtTCP8 and related TCP transcription factor(s).

通过分析水杨酸合成关键酶基因ICS1的启动子，鉴别出了具有负调控功能的区段；利用酵母单杂交筛选，鉴别出了转录因子TCP8。TCP8受多种胁迫信号诱导，且可以特异结合ICS1启动子；TCP8单突变体中未发现水杨酸信号的显著改变，但过量表达TCP8可以显著抑制胁迫诱导下ICS1的表达及水杨酸信号，表明TCP8可能通过负调控ICS1的表达参与诱导下的水杨酸平衡调控。此外，过量表达TCP8或抑制TCP8下游基因的表达均显著改变了拟南芥的生长与发育进程，显示其在生长发育过程中可能发挥着重要的作用。本项目拟开展以下研究：1）明确TCP8对ICS1的表达调控作用机制，鉴别功能冗余的TCP蛋白；2）探明TCPs与其它ICS1负调控因子的协同调控机制；3）阐明TCPs通过ICS1/SA的节点调控其它生长发育过程的关系，以便于全面理解ICS1节点/SA信号途径在植物生长发育中的广谱作用机理。

水杨酸（salicylic acid，SA）是一种重要的植物激素，在植物免疫反应和生长发育中发挥重要作用。ICS1（Isochorismate synthase 1）是拟南芥体内合成SA的关键酶基因，参与拟南芥生长发育及响应病源诱导SA的合成。本研究通过构建ICS1启动子驱动报告基因GUS和LUC的表达系统，鉴别出了ICS1启动子上的重要调控区段。基于该区段启动子进行的酵母单杂交鉴别出了ICS1的上游调控因子TCP8。凝胶阻滞实验（EMSA）和染色质免疫沉淀分析（ChIP）进一步证明TCP8能够识别并结合到ICS1启动子ATG上游145bp至152bp处保守的TCP结合位点。TCP8属于拟南芥TCP家族I类转录因子，定位于细胞核中，具有转录激活能力。拟南芥叶片原生质体系统分析和诱导过量表达试验表明，TCP8是ICS1的正调节因子，可以激活ICS1的转录。进一步研究表明，TCP8的同源蛋白TCP9是调控ICS1的冗余蛋白，TCP8和TCP9均在ICS1的表达上发挥显著的调控作用。双分子荧光互补（BiFC）和蛋白质体外结合（Pull-down）试验显示，TCP8可以与已报道的ICS1表达调控因子SARD1、WRKY28和NAC019在植物体内互作，揭示了体内ICS1表达调控机制的复杂性。TCP8在拟南芥生长发育各个阶段均有表达，本研究通过融合显性抑制子（EAR）抑制TCP8下游基因表达及过量表达TCP8来分析其功能。结果表明，TCP8在拟南芥生长发育进程中具有重要的调控作用，其过量表达显著降低植株的生长速率和抑制开花进程。定量PCR及突变体阻断分析表明，TCP8调控的拟南芥开花依赖于自主通路基因FCA、FLD及FLC。本研究取得的进展表明，TCP8转录因子可正调控ICS1表达，且可与其它转录因子互作，对ICS1进行协同调控。这不仅有助于说明TCPs蛋白对ICS1调控的特殊作用，而且有助于理解不同条件下ICS1的系统调控机制。TCP8在拟南芥的正常生长发育过程中发挥着重要的作用，这有助于理解TCP8及类似TCPs转录因子调控其它生物学过程尤其是开花过程的分子机理，暗示ICS1或SA信号途径在植物正常生长过程中发挥着广普的作用。部分工作已发表在植物学权威期刊The Plant Journal上，另外1篇文章在撰写中；申请发明专利1项。