Duddingtonia flagrans 厚垣孢子特性及萌发/休眠机制的初步研究

Widespread distribution and emergence of anthelmintic resrstance(AR) in gastrointestinal nematodes(GIN) of domestic animals has caused serious problems in worldwide livestock production. To suppress the development of AR, using chlamydospores of Duddingtonia flagrans, a nematophagous fungus, as biological agents for the control of GIN has now been one of the hot topics in veterinary parasitology. However, an important scientific problem of applied basic research for bio-control, namely the germinting, resting and other biological characteristics of chlamydospores of Duddingtonia flagrans is not currently resolved. In this project, the chlamydospores of Duddingtonia flagrans will be considered as a subject of reseach. In brevity, the influence of physical and chemical factors on the germination of Duddingtonia flagrans chlamydospores and their man-inducted germination/dormancy will be studied. Furthernore, a possible mechanism of germination/dormancy of chlamydospores will be explored by using the flcorescent probe dye, electron microscopy and biochemical methods. Expectation results will pivide theoretic support for the development and application of bio-control agents in animal parasitosis and have important scientific implication and potential in production.

家养动物胃肠线虫的广泛传播和其对驱虫药抗药性的出现，引起了全世界牧业生产的严重问题。为了控制线虫抗药性的蔓延，利用食线虫真菌Duddingtonia flagrans 的厚垣孢子进行生物防治是目前的研究热点之一。然而，涉及到生物防治应用中的重要基础研究问题，即Duddingtonia flagrans 厚垣孢子相关生物学特性以及萌发与休眠等尚未解决。本研究以Duddingtonia flagrans 的厚垣孢子为研究对象，通过人工诱发厚垣孢子的休眠与萌发，采用荧光分子探针技术、电子显微镜技术和生物化学分析技术，研究各种理化因素对厚垣孢子的影响、孢子萌发与休眠的形成和解除条件；探讨孢子萌发与休眠的初步机制。预期结果可为研制动物寄生线虫病生防制剂及其应用提供理论支撑，具有重要的科学意义及潜在的应用价值。

食线虫真菌Duddingtonia flagrans是一种重要的动物寄生虫病的生物防治菌种。相对于其它食线虫真菌，该菌能够大量产生厚垣孢子，这种孢子能够通过动物消化道而不易被灭活。因此，厚垣孢子在生防制剂中作为有效成分发挥杀线虫作用，然而厚垣孢子的很多特性尚不明了。本项目对D. flagrans厚垣孢子的各种生物学特性以及孢子休眠/萌发的机制进行了研究，取得了以下成果：（1）明确了不同温度、pH、光照、渗透压、干燥等物理因素以及6种碳源和3种氨基酸对厚垣孢子萌发的影响。在此基础上，也明确了不同处理的厚垣孢子对捻转血矛线虫三期幼虫（L3）的杀虫作用，其中较高温度的湿热处理对孢子活性和杀虫性能会造成致命的影响，干燥处理对孢子的萌发率有明显影响，但对杀虫性能影响不大。（2）明确了四种抗寄生虫药物（芬苯达唑、噻苯咪唑、左旋咪唑、伊维菌素）、四种化学杀真菌剂（多菌灵、甲霜灵、五氯硝基苯、苯醚甲环唑）、两种抗真菌药（两性霉素B和酮康唑） 对厚垣孢子萌发的影响。（3）揭示了孢子在脱水 、缺氧等环境中能够进入结构性休眠状态，明确了解除这种休眠的条件是将孢子置于低温或28℃（RH90%以上）的环境中存放7d 以上，孢子休眠主要与湿度变化有密切关系。（4）明确了MTT法染色在普通显微镜下可区分休眠孢子和死孢子的方法，利用激光共聚焦和荧光显微镜，观察了休眠孢子和非休眠孢子的代谢活性、细胞核以及细胞壁的差异，利用电镜观察了休眠孢子、非休眠孢子、萌发孢子细胞内的超微结构差异。（5）对不同阶段厚垣孢子，通过测定孢子壁黑色素、孢子内葡萄糖、海藻糖、甘油、脂肪酸、蛋白质和cAMP的含量，初步揭示了孢子休眠/萌发的生化机制。（6）通过萌发孢子、菌丝和休眠孢子比较转录组测序，分析了差异表达基因以及表达基因的功能注释、KEGG富集分析和q-PCR的验证，初步揭示了孢子萌发/休眠的分子生物学机制。以上研究结果为D. flagrans生物防治动物寄生虫病提供理论依据，为真菌厚垣孢子萌发/休眠的研究增添了新的内容。