Trx1及其氧化还原修饰在黄连素抗类风湿性关节炎中的作用及分子机制

Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease causing a high disability rate. Recent studies suggested that RA was subtly regulated by oxidative stress. Trx1, a critical antioxidative protein, play an important role in RA, however, the underlying molecular mechanisms remain unclear. In the previous study, we found that berberine (BBR) was capable of inducing Trx1 expression in both macrophages and fibroblast-like synoviocytes. Intriguingly, BBR could suppress stress-induced oxidative modification of cysteine residues on Trx1. Moreover, BBR mediated the anti-inflammatory and anti-oxidative effects via a Trx1-dependent mechanism. Base on these findings, we will apply non-reducing SDS-PAGE combined with specified cysteine mutations to clarify the molecular mechanisms regarding BBR-mediated redox modifications of Trx1. Immunoprecipitation followed by mass spectrometry analysis will be performed to identify the Trx1 interactive proteins and elucidate the role of these proteins in BBR-regulated inflammation. Subsequently, we will investigate the function of Trx1 in the anti-arthritis effects of BBR using CIA arthritis mouse model. Moreover, in vivo studies using clinical samples will be used to evaluate the potential of Trx1 as a candidate diagnostic biomarker or therapy target. Our project will decipher anti-inflammatory and anti-oxidative mechanisms of BBR and pave the way for the clinical application of BBR in RA treatment.

类风湿关节炎（RA）是一种致残率极高的慢性炎症疾病，严重危害人类健康。研究发现，氧化应激与RA密切相关，而Trx1作为细胞抵抗氧化应激的重要分子，在RA中发挥重要作用，但具体机制尚不清楚。我们前期研究发现：黄连素（BBR）促进巨噬细胞及成纤维样滑膜细胞中Trx1蛋白的表达，抑制氧化/炎症应激诱导的Trx1蛋白的氧化修饰，并且BBR的抗炎抗氧化作用依赖Trx1。本项目拟在此基础上通过非还原性免疫印迹、半胱氨酸定点突变等方法，阐明BBR对Trx1氧化还原修饰的调控机制；通过免疫沉淀/质谱分析筛选鉴定Trx1直接调控靶标，揭示其在BBR介导炎症负性调控中的作用；通过CIA关节炎小鼠模型及Trx1的体内沉默表达，明确Trx1在黄连素抗关节炎中的作用；进一步结合RA临床样本，明确Trx1作为RA的诊断标志物或治疗靶点。本项目将阐明黄连素抗炎抗氧化作用的具体机制及其临床治疗RA的潜在应用价值。

氧化应激与炎症密切相关，两者是众多疾病发生的重要病理基础。本项目立足于探索细胞内重要的氧化还原调节分子Trx1在炎症中的调控作用及其作用机制，根据计划的研究目标和路线，在建立稳定的氧化还原蛋白修饰检测方法的基础上，探索并证实了抗炎药物黄连素对 Trx1表达、活化和氧化还原修饰的调控，通过Trx1野生型及其氧化还原活性位点的双突变载体结合免疫共沉淀和蛋白组学技术，发现并验证了炎症反应过程中与Trx1以二硫键相互作用的靶蛋白DDX17。采用BIAM法（生物标记素的碘乙酰胺）首次证实DDX17是一个典型的氧化还原蛋白，采用免疫共沉淀联合非还原SDS-PAGE的方法证实DDX17可通过分子间二硫键形成同源二聚体。在小鼠CIA关节炎模型中，虽未能证实黄连素可明显改善小鼠关节病变情况，推测可能原因是黄连素的水溶性低以至于药物在关节腔中的有效浓度降低，因而尚不足以扭转病理改变。但是，我们新发现DDX17沉默后小鼠关节病变严重程度增加，血浆GSH/GSSG氧化还原电位升高向氧化方向偏移，这提示了DDX17参与机体氧化还原态的调控。同时，我们发现在类风湿关节炎（RA）患者来源的成纤维样滑膜细胞中，H2O2和LPS能够诱导内源性DDX17蛋白发生氧化修饰，提示了DDX17与RA的发生发展具有相关性。本研究发现了Trx1对DDX17的直接调控作用，一方面对广泛存在于机体的重要硫氧还蛋白Trx1在胞内的调控作用机制有了新的认识和补充，另一方面首次揭示了DDX17可以被氧化还原修饰及其在关节炎中的作用，可加深我们对氧化应激与炎性反应交汇整合的认识，为解明炎症的负性调控机理提供了新的证据和靶点，有明确的科学意义。