玉米耐铅候选基因ZmbZIP107的功能研究及分子机制解析

Maize is the most important food, economic, feed and industrial raw material in China and even in the world. Excessive levels of heavy metals in the soil pose a threat to corn growth and food security. Currently, the studies of corn on responding to heavy metals stress are mainly limited to genome-wide genetic analysis, however only a few genes controlling lead tolerance were identified. It is still unclear about the molecular mechanism of lead tolerance regulated by candidate genes. Our previous study revealed that ZmbZIP107, a lead-tolerant candidate, was involved in the response of maize to lead., Furthermore, the function of ZmbZIP107 was preliminarily revealed by using Arabidopsis mutant, yeast mutant and maize inbred lines with extreme phenotypes. In this study, candidate gene association analysis will be used to identify significant association sites within this gene and to determine its superior haplotype. The function of ZmbZIP7 will be verified by overexpression, Crispr/Cas9 method and analysis of Uniform Mu mutant. By combining KEGG way analysis, ChIP-Seq, and molecular interaction test, we plan to identify the target genes downstream ZmbZIP7 and the upstream regulatory genes. The expression pattern of the downstream and upstream genes will be analyzed by RT-PCR. Similarly, Crispr/Cas9 gene editing technology (or Uniform Mu mutant) will be used for functional validation of the downstream/upstream genes. As a result, a molecular pathway about ZmbZIP107 regulating lead tolerance will be constructed.

玉米是我国乃至全世界最重要的粮食、经济、饲料及工业原材料。土壤重金属的超标，对玉米的生长及粮食安全造成威胁。目前玉米应答重金属胁迫的研究大多数局限于全基因组遗传解析和基因表达调控上，而耐铅功能基因及其分子作用机制报道甚少。前期研究发现转录因子ZmbZIP107应答玉米铅胁迫，其功能在拟南芥、酵母突变体及玉米极端材料中得到了初步鉴定。本项目拟采用候选基因关联分析确定优异单倍型，并利用过表达、Crispr/Cas9基因编辑及Uniform Mu突变体验证该基因的功能。结合KEGG way分析、ChIP-Seq以及分子互作试验预测并验证该基因下游靶基因和上游调控因子，并利用RT-PCR分析上下游基因的表达模式。最后采用Crispr/Cas9基因编辑或Mu突变体验证下游靶基因或上游基因的功能，从而构建ZmbZIP107调控玉米耐铅功能的分子通路。

鉴定和挖掘玉米耐铅基因是玉米抗重金属育种培育的关键。为了解析玉米耐铅机制，本项目在课题前期研究基础上，开展了全基因组关联分析与功能研究等工作，获得的主要结果如下：利用286份玉米自交系构成的自然群体，结合47421个高质量的SNP对铅胁迫下的玉米幼苗丙二醛含量和叶绿素含量进行全基因组关联分析，不仅进一步确定候选基因ZmbZIP107参与了玉米铅胁迫调控，而且挖掘到新的候选基因。在拟南芥中过表达候选基因ZmbZIP107并鉴定铅胁迫下的植物表型，结果发现过表达ZmbZIP107能够提高拟南芥对铅胁迫的耐受性，而拟南芥中bZIP107的同源基因突变体与野生型相比铅胁迫的耐受性显著降低。对玉米、拟南芥及水稻三个物种的bZIP家族进行分类以及共线性分析，发现bZIP蛋白在三个物种中的染色体上的分布均匀，通过对玉米bZIP家族进行分类发现ZmbZIP107与参与铅胁迫的ZmbZIP54同属于一类，可以推断ZmbZIP107是玉米铅胁迫应答的一个新基因。另外，在玉米中，过表达ZmbZIP107也显著提高了玉米幼苗根系对铅胁迫的耐受性。通过转录组分析，挖掘到392个差异表达的基因，这些基因可能参与玉米铅胁迫分子调控机制。进一步差异表达基因进行GO分析和KEGG pathway分析，发现差异基因主要显著富集在植物信号转导途径、MAPK信号途径、植物次生代谢产物的生物合成途径等。结合转录组分析结果，我们通过筛选酵母文库以期挖掘ZmbZIP107相互作用的基因，进一步解析其耐重金属的分子机制。将过表达ZmbZIP107的株系通过连续回交的方法导入到B73、Mo17以及郑58等常规自交系中，发现候选基因ZmbZIP107能够改良部分自交系部分性状受到铅胁迫后的玉米表型，证明ZmbZIP107在玉米的耐重金属育种中具有一定的应用价值，但是其应用价值还有待进一步鉴定。这些结果表明候选基因ZmbZIP107在玉米铅胁迫响应过程中发挥着重要的作用。本项目为进一步利用基因工程的方法创制和培育玉米耐铅品种，提高玉米产量和品质提供目标基因和理论指导。