蠲脉Ⅰ号温阳拆方对兔ASO模型血管细胞内钙离子调节的研究

The subiect according othe principle of Chinese medicine"treating difference disease with the same method",ASO pthogenesis of senile kidney yang vascular cells related to intracellular calcium ocerload hypothesis proposed in the existing literature and their own pre-study basis.JM No.1 WYCF selected clinically effective for the experiment:(1)the overall experiment:sub-mormal group,model group,sham operation group,JM No.1 WYCF group,JM No.1 group,Treated with rabbit ASO model.Detection of blood rheology,biochemical NO,thromboxane,6-keto prostaglandin and other indicators and changes in intracellular calcium in vascular cells and vascular cell expression of calmodulin.Compare the various indicators and the vascular tissue exppression of calmodulin;(2)In vitro experments:Normal control group;AngⅡgroup;AngⅡ+JM No1.WYCF group;AngⅡ+JM No.1group;Each group were observed to inhibit the in vitro VSMC proliferation induced by Ang II experiment,Detection of VSMC proliferation cycle and apoptosis changes,The laser scanning confocal microscope dynamic observation of intracellular calcium, compared to the JM No.1WYCF activity effects on VSMC CaM.This confirms the hypothesis of the scientific, and provide a new theoretical basis for traditional Chinese medicine early prevention of ASO, and lay the foundation for the clinical development of new drugs.

本课题根据中医"异病同治"原则，在既有文献和自身前期研究基础上提出ASO的发病机制与老年肾阳虚血管细胞内钙超载相关的假说。选临床有效方蠲脉Ⅰ号的温阳拆方进行实验：（1）整体实验：分正常组、模型组、假手术组、蠲脉Ⅰ号温阳拆方治疗组、蠲脉Ⅰ号全方治疗组，用兔ASO模型接受治疗，检测其血液流变学、生化、NO、血栓素、6酮前列腺素等指标和血管细胞内钙离子变化以及血管细胞钙调蛋白的表达，对比诸项指标与血管组织钙调蛋白的表达；（2）体外实验：分正常对照组、血管紧张素组、血管紧张素+蠲脉Ⅰ号温阳拆方组、血管紧张素+蠲脉Ⅰ全方组4组，观察各组对抑制血管紧张素诱导的体外血管平滑肌细胞增殖实验的影响，检测其增殖周期和凋亡变化，激光共聚焦显微镜动态观察细胞内钙，对比该方对血管平滑肌细胞中钙调蛋白的活性影响。以此印证假说的科学性，为中医早期防治ASO提供新的理论依据,并为研发临床新药奠定基础。

按项目申请书要求探索复制贴近中医证型的兔ASO模型，历经3年反复实验终获成功，2016年的实验中运用"反证法"初步验证了肾阳虚ASO中医证型，2017年按新方法行整体实验，自9月起开始蠲脉Ⅰ号温阳拆方对兔ASO模型血管细胞内钙离子调节的研究，实验随机分为5组，每组7只，共计35只；A组正常对照组；B组：假手术组；C组：模型组；D组：蠲脉Ⅰ号温阳拆方组；E组：蠲脉Ⅰ号全方组；F组：金匮肾气丸组。方法：A、B、C组仅予服等剂量凉白水，D、E、F组各按6克生药/kg灌胃。按1、14、30、60、90、120天动态观察各项指标，实验期间随时根据动物体重变化调节给药剂量。第120天实验取材，样本按项目申请书（第3.1.2.3项）要求逐项检测。体外实验 检测实验药物毒性、调整实验药物剂量；制作实验药物血清。购入原代血管平滑肌细胞，按项目申请书（第3.1.3项）分组复制细胞模型之后给予药物干预。流式细胞仪（3H-TDR掺入技术观察VSMC增殖；检测细胞内钙离子（比色法）；提取相关蛋白定量检测（PCR）；用荧光染色Fluo-4法检测VSMC内钙离子；激光共聚焦显微镜动态检测各组VSMC内钙离子浓度；另提取RNA检测相关动脉run5；Smul-1目的基因，完成检测及实验数据搜集。（2）取得的主要研究进展、重要结果、关键数据等及其科学意义及应用前景。本项目研究取得上述进展尤其是下列研究的重要进展具有极重要的意义。①项目申请书中提出的设想——复制尽可能贴近中医证型的兔ASO模型已经成功完成；②本项目研究的金匮肾气丸分组实验结果证实所提出的“反证法”可用于今后其他中医证型动物模型的实验研究，其结果具有良好的科学意义及应用前景。